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1. 如果收到一管凍存的細胞，能直接把它放到液氮中保存嗎？
在很多情況下，干冰（-80°C）運輸的細胞可以放回液氮，之后再進(jìn)行快速解凍。然而，這樣處理后可能降低細胞活力。對于一些敏感的細胞系，這可能使細胞復蘇更加困難。這種現象被認為是由于溫度變化導致的細胞內冰晶結構的改變。因此，建議細胞在收到后應盡快解凍和培養。減少在-80°C的儲存時(shí)間，這種溫度只用于運輸。
2. 從液氮中取出細胞復蘇時(shí)，應采取哪些安全措施？
在液氮中的細胞凍存管如果沒(méi)有*密封，有液氮漏入，解凍時(shí)凍存管的氣溫急劇上升，可能會(huì )導致爆炸。因此，當從液氮中取出細胞時(shí)，建議佩戴護目鏡和防護手套。復蘇時(shí)，應將凍存管在37°C水浴中不斷搖動(dòng)，在1-2分鐘內使凍存液*融化。之后用酒精棉球擦拭凍存管外壁，再拿入超凈臺內，將細胞轉移到已加入10ml培養液的離心管內，1000 rpm下離心5～10分鐘，棄去上清液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，置 5% CO2孵箱靜置培養。
3、為什么應將細胞儲存在液氮罐中的氣相而非液相？
細胞儲存在液氮氣相中更容易復蘇。而在液氮的液相中，如果凍存管沒(méi)有正確密封或有泄漏，細胞與液氮直接接觸，會(huì )使細胞解凍后活力受到影響。
4、對于懸浮細胞，如何更換培養基？
培養懸浮細胞可以只是簡(jiǎn)單地添加新鮮培養基（如果空間允許）或者通過(guò)離心（100×g 5分鐘）從舊培養基中分離細胞，隨后將沉淀的細胞再懸浮于新鮮培養基中。然而，對于大多數懸浮細胞系，簡(jiǎn)單添加培養基是更好的方法。無(wú)論哪種方法，都需要細胞達到其zui大飽和密度之前更新培養基。細胞的飽和密度在3×10 5至2×10 6之間，具體依賴(lài)于細胞系和培養條件（靜置或攪動(dòng)、氧合水平等）。細胞必須稀釋至較低的細胞濃度以允許足夠的營(yíng)養物質(zhì)恢復，使細胞保持對數生長(cháng)。假如只是簡(jiǎn)單地更換培養基而不降低細胞密度，細胞就會(huì )迅速耗竭培養基并死亡。如果細胞被稀釋到其zui小密度之下，則會(huì )進(jìn)入滯后期，生長(cháng)非常緩慢，或者會(huì )死亡。每種懸浮細胞系的飽和密度和傳代間隔都不一樣，因此，每日細胞計數是監測懸浮細胞系的*方式。
5. 細胞培養推薦的CO2水平是多少？
盡管細胞培養體系中的CO2水平范圍為0.03％~40%（通常大氣中的CO2約0.03％），但zui常見(jiàn)的在空氣中不添加CO2或者CO2濃度為5％~10％。調節培養基中碳酸氫鈉的濃度以與氣相中CO2水平達到平衡非常重要。細胞會(huì )產(chǎn)生CO2，需要少量的碳酸用于生長(cháng)和存活。如果不添加CO2并且細胞大量繁殖，則可以使用4mM（0.34g / L）的無(wú)水碳酸氫鈉。然而，這時(shí)培養瓶蓋子應擰緊。如果培養體系需要5％或10％的CO2，則在37℃下分別使用23.5mM（1.97g / L）或47mM（3.95g / L）碳酸氫鈉，初始pH為約7.6。在這些條件下，應使培養瓶松蓋或使用培養皿來(lái)保持氣體平衡。
6. 為什么一些細胞需要丙酮酸鈉？我應加多少丙酮酸鈉到培養基中？
丙酮酸鹽是糖酵解途徑中的*個(gè)容易進(jìn)出細胞的有機酸代謝物。 因此，培養基中添加丙酮酸鈉能同時(shí)為合成代謝提供能量源和碳源，有助于維持某些特定的細胞，有助于細胞克隆或者在培養基中血清濃度降低時(shí)需要。丙酮酸鈉還有助于降低熒光引發(fā)的細胞毒性。通常加入的丙酮酸鈉終濃度為1mM。商品化的丙酮酸鈉溶液通常為100mM儲存液（100X）。
7. 培養瓶、培養板和培養皿中的細胞密度是多少？
請參考如下數據：
培養瓶 | 培養面積 | 培養液體積 | 細胞產(chǎn)量 |
T25 | 25cm2 | 5-10 ml | 2.5 x 106 |
T75 | 75cm2 | 15-20 ml | 7.5 x 106 |
T150 | 150cm2 | 30-50 ml | 15.0 x 106 |
T175 | 175cm2 | 35-60 ml | 17.5 x 106 |
T225 | 225cm2 | 45-75 ml | 22.5 x 106 |
細胞產(chǎn)量根據細胞密度1 x 106 cells/ cm2進(jìn)行的估算。
細胞培養皿/板 | 培養面積 | 培養液體積 | 細胞產(chǎn)量 |
100 mm平皿 | 44 cm2 | 9 ml | 44 x 105 |
6孔培養板 | 9.40 cm2 | 2.0 – 3 ml | 9.4 x 105 |
12孔培養板 | 3.83 cm2 | 1.0 – 2.4 ml | 3.83 x 105 |
24孔培養板 | 1.88 cm2 | 0.5 – 1.2 ml | 1.88 x 105 |
48 孔培養板 | 1 cm2 /孔 | 0.3 – 0.6 ml | 1.0 x 105 |
96孔培養板 | 0.32 cm2 | 0.1 – 0.2 ml | 0.32 x 105 |
384孔培養板 | 0.06 cm2 | 25 – 50 ml | 0.06 x 105 |
細胞產(chǎn)量根據細胞密度1 x 105 cells/ cm2進(jìn)行的估算。
多孔板中細胞的接種密度：
成像時(shí)*密度通常為7500-20000個(gè)細胞/孔（96孔板）和1000-4000個(gè)細胞/孔（384孔板）。 細胞密度過(guò)高會(huì )導致自動(dòng)對焦困難，特別是如果細胞長(cháng)滿(mǎn)，并且擠在一起，通常會(huì )導致一些細胞位于焦點(diǎn)之外。細胞密度過(guò)低，導致許多空白區域和焦點(diǎn)損失，特別是在使用較高放大倍數時(shí)。接種密度可以通過(guò)在培養板上接種不同稀釋濃度的細胞，并使其在實(shí)驗條件下生長(cháng)（可以促進(jìn)或阻止生長(cháng)）來(lái)評估。
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