維生素B12測定培養基

原理

乳酸桿菌生長(cháng)需要特別的營(yíng)養，因而在非選擇性培養基上很難生長(cháng)。維生素測定用培養基用于維生素的微生物法測定。該方法需要三種培養基：即維持培養基，用于保持菌種活力；接種培養基，用于測試菌液的制備；測定用培養基，用于待測維生素的定量。

維生素B12測定用培養基                        

維生素B12測定用培養基，不含維生素B12，但包含所有其他維生素和必要養分，用于萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）的生長(cháng)。萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測定用菌，zui早由Capp等人描述（1）并被美國藥典和美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì )（AOAC）所推薦（2，3）。

用已知稀釋度的維生素B12標準品，可以制備標準曲線(xiàn)（2，3）。

測試菌液的制備是將將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養基中，推薦在37°C 孵育24 小時(shí)，再離心、清洗、重懸于10 ml 生理鹽水中，再通過(guò)濁度分析或酸度分析，確定生長(cháng)反應。

  用維生素B12的濃度及對應的吸光度制作標準曲線(xiàn)。用標準曲線(xiàn)可確定待測樣本中的維生素B12的濃度。

應非常小心地避免培養基和玻璃器具的污染。應使用潔凈的無(wú)去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導致錯誤的結果。

用于接種的測定菌應在的培養基中培養。

應用

維生素B12測定用培養基推薦采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測定用菌，進(jìn)行維生素B12的微生物法測定。

培養基組分

成分                                     克/升

無(wú)維生素酸水解酪蛋白                 15.000

葡萄糖                               40.000

天門(mén)冬酰胺                           0.200

醋酸鈉                               20.000

抗壞血酸                             4.000

L-胱氨酸                             0.400

DL-色氨酸                            0.400

硫酸腺嘌呤                           0.020

尿嘧啶                               0.020

黃嘌呤                               0.020

核黃素（維生素B2）                   0.001

鹽酸硫胺素                           0.001

生物素                               0.00001

煙酸                                 0.002

對氨基苯甲酸（PABA）                0.002

泛酸鈣                               0.001

鹽酸吡哆醇                           0.004

鹽酸吡哆醛                           0.004

鹽酸吡哆胺                           0.0008

葉酸                                 0.0002

磷酸二氫鉀                           1.000

磷酸氫二鉀                           1.000

硫酸鎂                               0.400

氯化鈉                               0.020

硫酸亞鐵                             0.020

硫酸錳                               0.020

聚山梨酯80                           2.000

鹽酸鳥(niǎo)嘌呤                           0.020

zui終pH值 (25°C)                     6.1±0.2

質(zhì)量控制

Ø外觀(guān)——奶油色至黃色，具均勻性，傾向形成可容易分解成粉末狀的軟塊

Ø制備好的培養基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀

Ø配比濃度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.1±0.2

ØpH值——5.90-6.30

配置

稱(chēng)取8.45g干粉培養基溶于100ml蒸餾水，必要時(shí)加熱使培養基*溶解?；靹?，使輕微的沉淀均勻分布。測定時(shí)，分裝試管，每管為5ml培養基（包含標準品和待測樣品）。加蒸餾水，使總體積達到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻培養基。每個(gè)試管(10 ml)的維生素B12水平為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng時(shí)，均可獲得滿(mǎn)意結果。

培養反應

進(jìn)行微生物法測定維生素B12。采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830），35-37°C孵育18-24小時(shí)。

生長(cháng)狀況

隨著(zhù)測定管標準品水平升高，（美國藥典維生素B12標準水平，0，0.025,0.050，0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng)，目標菌生長(cháng)逐漸遞增，伴隨著(zhù)620nm處吸光度的增加。

文獻

1.  Capps B. E., Hobbs M. H. H. and Fox S. H., 1949, J. Biol. Chem., 178:517.

2. The United States Pharmacopoeia, 2006, USP29/NF24, The United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.

3.  H. Williams, (Ed.), 2005, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 19th Ed., AOAC,Washington, D.C