支原體檢測 常見(jiàn)答疑

問(wèn)：在用qEP做支原體檢測的時(shí)候，加入內控對照品，在儀器設置上是需要選擇兩個(gè)通道嗎？

答：是需要2個(gè)通道，一個(gè)FAM, 一個(gè)HEX，HEX是對應內控的通道。

問(wèn)：我想問(wèn)一下，7500儀器里面沒(méi)有HEX這個(gè)通道選項，可以用哪個(gè)通道代替呢？

答：7500這款是沒(méi)有HEX熒光標識，不過(guò)問(wèn)過(guò)廠(chǎng)家，說(shuō)7500有VIC，可以用VIC通道。

問(wèn)：qPCR結果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中這個(gè)不相關(guān)是具體指什么？

答：這個(gè)不相關(guān)是指如果FAM是陽(yáng)性，那么由于擴增時(shí)存在競爭性抑制，所以?xún)瓤厥欠裼袛U增，其無(wú)關(guān)緊要。

問(wèn)：在用樣品制備試劑盒時(shí)，進(jìn)行支原體DNA提取時(shí)，加入內控對照品，實(shí)際上是監控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA，而無(wú)法監測這步操作的回收率的，是嗎？

答：“實(shí)際上是監控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA”，可以這么理解，或者說(shuō)是在監測整個(gè)提取過(guò)程。我們又問(wèn)了一下廠(chǎng)家，內控和樣品的提取效率是一樣的，這樣可以反映樣品的真實(shí)情況，因為只要內控提取后能測出來(lái)，那就表明提取是沒(méi)有問(wèn)題的。極少量的支原體如10CFU的，通過(guò)提取，也是可以檢測到的，表明靈敏度是沒(méi)有問(wèn)題的。樣本Ct值和10CFU的Ct值比較，是可以進(jìn)行相對定量的。

問(wèn)：你們好，我問(wèn)一下你們這個(gè)Venor Gem qEP試劑盒能做放行檢測嗎?

答：放行應相當于國外說(shuō)的release testing, 這個(gè)qEP試劑盒是符合國外藥典規定的性能，能做放行檢測的。同時(shí)需注意要做支原體DNA抽提才行，抽提是用另外一個(gè)盒子，見(jiàn)廠(chǎng)家的venor gem sample preparation kit。

問(wèn)：這個(gè)如果是用來(lái)檢測細胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟藥典有關(guān)，跟臨床治療或制藥檢驗有關(guān)，就需要提取DNA。如果僅僅是科研用培養細胞，篩查支原體，則可以不提。

問(wèn)：詢(xún)問(wèn)qPCR儀器的設置

答：具體可見(jiàn)MB廠(chǎng)家文件Venor^®GeM qEP: Cyclers Programming，可從網(wǎng)站上下載。

問(wèn)：被動(dòng)參比染料是選“none”吧？

答：對，沒(méi)有ROX，選none

問(wèn)：大家好，想咨詢(xún)一下，咱們支原體DNA提取時(shí)所取的樣本量是依據什么定的呢，比如，我們有CAR-T細胞，病毒液等，如果CAR-T細胞按細胞數來(lái)的話(huà)取多少細胞數比較好，或者如果病毒液按體積的話(huà)多少體積更佳呢？

答：支原體 DNA 提取試劑盒可從多含有 1X 10⁶細胞/ml 的細胞上清中直接分離 DNA，病毒沒(méi)有要求?？傮w積多 200μl。提取的樣本就是細胞上清，ATMPs（高級醫用藥品），細胞培養基等。病毒液應該也是初來(lái)自細胞上清吧。樣本量是根據支原體污染量得出的經(jīng)驗值，跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關(guān)。

問(wèn)：病毒液就是類(lèi)似細胞上清的。如果體積大于200ul的話(huà)我們可以濃縮，但是這個(gè)體積有沒(méi)有一個(gè)上限呢？

答：體積有上限，是200 to 1000 µl, 可以參看經(jīng)典法試劑盒的那個(gè)說(shuō)明書(shū)里對樣本處理那一塊。這個(gè)樣本量同時(shí)還考慮了靈敏度，使檢測達到很好的靈敏度。如果細胞數高于1X 10⁶細胞/ml ，那必須要先調細胞數了?；蛘邷p少樣本體積，總細胞數不超，也行。

問(wèn)：您好，我這邊要提取10cfu對照品的基因組，10cfu對照品的說(shuō)明書(shū)寫(xiě)著(zhù)用1ml基質(zhì)重懸，基因提取試劑盒說(shuō)一次上樣200μl進(jìn)行提取，想問(wèn)您一下，用200μl基質(zhì)重懸10cfu可以嗎，想一次提完。

答：還是建議用1ml的基質(zhì)重懸，因為靈敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul，濃度就高了。廠(chǎng)家建議10CFU標準品復溶了以后，要立即用完，不要再保存，擔心可能降解。

問(wèn)：那1ml溶解的標準品，按提取試劑盒的要求，就得用多個(gè)管子一次提完對吧？

答：是的。

問(wèn)：這個(gè)抽提試劑盒的收率有多少，是磁珠還是吸附柱？吸附柱的收率能有，因為以前我們用其他品牌的抽提試劑盒，收率只有百分之六，這樣的話(huà)，就存在假陰性結果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里，用的是很少量的支原體10CFU/ml，提取DNA后都可以檢測到。廠(chǎng)家來(lái)信說(shuō)，產(chǎn)率依賴(lài)于DNA的類(lèi)型（如GC含量，是基因組還是質(zhì)粒）、操作者的技巧以及樣本基質(zhì)的情況。因為這些情況，操作者很難達到生產(chǎn)商所給的比率，從而形成各種討論，因此產(chǎn)率沒(méi)寫(xiě)到說(shuō)明書(shū)里。

問(wèn)：要檢測支原體的培養基中有酚紅，是否還需要抽提？

答：只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul，酚紅就不會(huì )對qPCR構成問(wèn)題。更高濃度的酚紅會(huì )引起基線(xiàn)偏移，造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查，則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產(chǎn)品放行檢查，則需要抽提了。細胞基質(zhì)的驗證總是要做的。

問(wèn)：做qPCR，一個(gè)陰性對照Ct約為40，也有擴增曲線(xiàn)。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于產(chǎn)生非特異性信號（如primer artefacts）以及極微小的污染所致。 但是，該結果是不具有可重復性的，因此結果仍然是陰性。

問(wèn)：一步法的盒子的靈敏度是否總低于經(jīng)典法試劑盒？有沒(méi)有可能一步法的盒子也能檢測10CFU？

答：廠(chǎng)家回復如下：意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查，經(jīng)典法為10ul，用于產(chǎn)品的放行檢測。檢測10CFU的標準品非常具有挑戰性。一步法因為樣本量不夠，很難達到10CFU/ml。如果客戶(hù)想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒，可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經(jīng)典法（不含酶）的交叉驗證確實(shí)做過(guò)，顯示同樣的靈敏度。但全套的驗證沒(méi)有做過(guò)。

問(wèn)：支原體10cfu標準品是干粉吧？ 配完后是多少體積？

答：是凍干粉，加基質(zhì)液后是1ML體積。

問(wèn)：基質(zhì)液產(chǎn)品里帶嗎？

答：這個(gè)產(chǎn)品里不帶，是客戶(hù)自己要檢測哪類(lèi)樣品，就用樣品里的基質(zhì)液（例如用的哪個(gè)培養基）

問(wèn)：PCR經(jīng)典法，跑膠時(shí)體現1條陽(yáng)性帶，是否代表PCR經(jīng)典法可以檢測多種支原體，無(wú)法區分支原體種類(lèi)。

答：PCR經(jīng)典法，跑膠時(shí)為1條陽(yáng)性帶，無(wú)法區分支原體種類(lèi)，需要將擴增產(chǎn)物測序鑒定。