和PCR比起來(lái)，qPCR不用跑膠，實(shí)時(shí)監測擴增狀況，操作更為便捷。下面以德國MB Venor®GeM支原體檢測試劑盒（qPCR一步法）（Venor®GeM qOneStep）為例，略述檢測原理和過(guò)程。

   該試劑盒包括4管試劑，其中2管分別為緩沖液和PCR水，另2管為主要試劑。1管即mix，含引物、核苷酸、聚合酶、熒光素標記的探針和內部擴增對照。另1管為陽(yáng)性對照，均為凍干粉。

它通過(guò)擴增高度保守的rRNA操縱子，或者更準確地說(shuō)，擴增支原體基因組中的16S rRNA編碼區，可以特異性地檢測支原體。在520nm（FAMTM通道）檢測支原體特異性擴增片段。在610nm（HEXTM通道）檢測內部擴增對照的擴增。它能特異性檢測所有導致細胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會(huì )被擴增。通過(guò)內部對照，可檢測PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結果。樣本為細胞培養上清液。檢測程序可在3小時(shí)內完成。

在檢測前，樣本需要一定的制備。具體是將100μl細胞培養上清液轉移至無(wú)菌的1.5 ml反應管中。關(guān)上蓋子扣緊。將樣品在95°C下孵育5分鐘。以大速度短暫離心樣品（15秒）以沉淀任何細胞碎片。然后可直接取2μl上清液進(jìn)行qPCR。

qPCR反應體系一共是25ul，其中樣本2ul，其余是master mix。注意設置陽(yáng)性對照、陰性對照（無(wú)模板對照）。

如果檢測的Ct<40，則表明PCR結果陽(yáng)性。如果檢測的Ct≥40，則PCR反應結果為陰性。如果FAM陽(yáng)性，則支原體陽(yáng)性。如果FAM陰性，HEX也陰性，表明PCR擴增出了問(wèn)題，需要重做。如果FAM陰性，HEX陽(yáng)性，表明支原體確實(shí)陰性。

PCR擴增出了問(wèn)題主要原因為PCR反應被抑制了，可能需要考慮做DNA抽提。

在qPCR反應中，引物和探針的設計尤為重要，它既需要覆蓋大多數支原體，又需要不與細菌和哺乳動(dòng)物細胞DNA發(fā)生交叉反應。當然，Taq酶的性能也很重要，因為DNA的擴增終依賴(lài)于酶的活性和擴增的速度。從這個(gè)角度說(shuō)，一個(gè)好的qPCR試劑盒是各個(gè)因素共同作用的結果。