支原體標準品的品控是保證質(zhì)量的關(guān)鍵

生物制品和細胞治療企業(yè)已越來(lái)越多地采用核酸法進(jìn)行支原體的檢查和生產(chǎn)質(zhì)控。核酸法如替代藥典方法，則需進(jìn)行方法驗證。

現在一些地方在使用德國MB公司的支原體標準品或支原體基因組DNA（定量標準品），包括靈敏度標準品（10CFU,100CFU）、特異性標準品以及PCR定量標準品，其中靈敏度標準品也可用于耐用性的驗證。

MB廠(chǎng)家具有ISO 9001和ISO 13485質(zhì)量體系認證。每個(gè)批次支原體標準品都有驗證和質(zhì)控。同時(shí)支原體培養所用的培養基每個(gè)批次都符合歐洲藥品質(zhì)量管理局（EDQM）的標準。標準品每個(gè)批次都提供有質(zhì)控證書(shū)（COA）。標準品所用的支原體菌株來(lái)自英國NCTC菌種保藏中心，同時(shí)具有相應的ATCC編號。

下面對MB廠(chǎng)家的三類(lèi)標準品的質(zhì)控方面做一介紹。

（一）支原體靈敏度標準品

10CFU™支原體靈敏度標準品為滅活支原體，這樣不會(huì )對實(shí)驗室造成支原體污染。它用于核酸法的靈敏度和耐用性驗證。它每盒含3管10CFU支原體凍干粉，2管陰性對照。靈敏度標準品主要經(jīng)過(guò)下列三方面的質(zhì)控：

1. 功能檢測：

即標準品復溶后作DNA抽提（采用MB公司的Venor®GeM Sample Preparation Kit），再用符合藥典標準的qPCR試劑盒檢測，應保證有擴增曲線(xiàn)。

2. 活力檢測：

即標準品在培養基中復溶并培養7天后，再進(jìn)行DNA抽提和qPCR檢測，Ct值和對照組比，應不超過(guò)允許閾值（ΔCt >2）。該檢測主要是確保支原體均已滅活。

3.di閾限檢測和批次合格標準：

標準品用DMEM+5%FCS進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)纬?個(gè)稀釋度，DNA抽提后然后進(jìn)行前后3輪qPCR檢測，每輪每個(gè)稀釋度重復8次。每種支原體的Ct平均值應達到一定標準，方為合格。

（二）支原體基因組DNA——特異性驗證用

該基因組DNA是從相應的支原體中抽提出來(lái)，并制成凍干粉。每管為10ng左右。復溶時(shí)，每管加100ml廠(chǎng)家提供的Tris緩沖液，室溫靜置5分鐘，再渦旋離心5秒鐘。

廠(chǎng)家對基因組中的16S rRNA段進(jìn)行了序列分析，要求應與相應支原體物種的同源性應達到99%以上。對制備的DNA質(zhì)量和數量進(jìn)行了熒光分析和PCR擴增。PCR擴增應顯示為單一的擴增條帶。

（三）PCR定量標準品

每管為1x108拷貝的支原體物種基因組DNA凍干粉，使用時(shí)也是先用廠(chǎng)家提供的Tris緩沖液復溶。質(zhì)控時(shí)，對16S rRNA的部分序列進(jìn)行測序分析，以鑒定支原體物種，測序結果應顯示為99%以上的同源性。再對該標準品作系列梯度稀釋?zhuān)龠M(jìn)行qPCR擴增，應顯示為良好的線(xiàn)性。該方法還可確定qPCR方法的檢測閾值。

MB公司的上述三類(lèi)標準品可用于對支原體核酸法的方法學(xué)驗證，包括靈敏度、特異性和耐用性。其中，基因組DNA除了包括常見(jiàn)支原體物種外，還包括一些常見(jiàn)細菌，用于驗證常規PCR或qPCR的檢測是否會(huì )產(chǎn)生交叉反應。

總之，良好的質(zhì)控是標準品品質(zhì)的保證，這樣才能確保方法驗證結果的可靠性，使支原體的核酸法檢測符合藥典所規定的標準，從而為替代培養法等經(jīng)典支原體的檢測方法提供數據支持。

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