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杜克大學(xué)的生物醫學(xué)工程師團隊創(chuàng )造了一種新方法，可以通過(guò)掌握基因調控網(wǎng)絡(luò )的語(yǔ)言將干細胞轉變?yōu)樗璧募毎?lèi)型將干細胞編程為其他細胞類(lèi)型并不是一個(gè)新主意。已經(jīng)存在幾種方法，但是結果還有些不足。通常，在實(shí)驗室中培養時(shí)，程序化的干細胞不能正確成熟，因此，尋求成年神經(jīng)元細胞進(jìn)行實(shí)驗的研究人員可能終會(huì )得到胚胎神經(jīng)元，而胚胎神經(jīng)元將無(wú)法模擬遲發(fā)性精神病和神經(jīng)退行性疾病。
杜克大學(xué)博士喬希·布萊克(Josh Black)說(shuō)：“乍一看，這些細胞似乎是正確的。” 查爾斯·格斯巴赫(Charles Gersbach)實(shí)驗室負責這項研究的學(xué)生，“但是他們常常缺少您想要的那些單元格中的一些關(guān)鍵特性。”
使用CRISP基因編輯技術(shù)，魯尼生物醫學(xué)工程系副教授兼高級基因組技術(shù)中心主任Gersbach領(lǐng)導的實(shí)驗室創(chuàng )建了一種方法，該方法可識別哪些轉錄因子(基因活性的主要控制者)對于使轉錄因子成為關(guān)鍵。好的神經(jīng)元。
他們的工作發(fā)表在12月1日的《細胞報告》中，展示了該方法制造成熟的成年神經(jīng)元的潛力，但是它可以用于編程任何類(lèi)型的細胞。
CRISPR技術(shù)常用于編輯DNA序列，稱(chēng)為“基因組編輯”，其中Cas9蛋白與引導RNA結合，引導RNA引導Cas9在特定位置切割DNA，從而導致DNA序列發(fā)生變化。格斯巴赫說(shuō)：“ DNA編輯已廣泛用于改變基因序列，但這在基因被關(guān)閉的情況下無(wú)濟于事。”
不過(guò)，失活的Cas9(dCas9)蛋白將附著(zhù)在DNA上而不切割。實(shí)際上，如果沒(méi)有其他分子附著(zhù)或吸收它，它通常不會(huì )做任何事情。Gersbach和他的同事先前已經(jīng)報道了將不同分子結構域連接到dCas9蛋白罐的多種方法，這些方法將告訴細胞打開(kāi)基因并重塑染色質(zhì)結構。
當布萊克加入格斯巴赫實(shí)驗室時(shí)，他對使用這些工具打開(kāi)可以將一種細胞類(lèi)型轉化為另一種細胞從而創(chuàng )建更好的疾病模型的基因感興趣。
在2016年，Black和Gersbach報道了一種使用基于CRISPR的基因激活劑來(lái)開(kāi)啟基因網(wǎng)絡(luò )的方法，該網(wǎng)絡(luò )會(huì )將成纖維細胞(一種易于接觸的組成結締組織的細胞類(lèi)型)轉化為神經(jīng)細胞。這項研究針對的是已知與神經(jīng)元規格有關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò )，但并未產(chǎn)生具有建立有效疾病模型所需的所有特性的細胞。但是，產(chǎn)生這些所需細胞的正確基因網(wǎng)絡(luò )尚不清楚，并且人類(lèi)基因組中編碼了成千上萬(wàn)種可能性。因此，Black和Gersbach設計了一種策略，可以在一個(gè)實(shí)驗中測試所有網(wǎng)絡(luò )。
他們從多能干細胞開(kāi)始，因為這種細胞類(lèi)型應該能夠變成人體內的任何其他細胞。為了利用干細胞制造成熟的神經(jīng)元，該團隊設計了一旦成為神經(jīng)元的干細胞就會(huì )發(fā)出紅色熒光。熒光越亮，對神經(jīng)元命運的推動(dòng)越強。然后，他們建立了一個(gè)匯集了數千個(gè)指導RNA的文庫，這些RNA靶向人類(lèi)基因組中編碼轉錄因子的所有基因。轉錄因子是基因網(wǎng)絡(luò )的主要調節因子，因此，要生成所需的神經(jīng)元，必須將所有正確的轉錄因子都打開(kāi)。
他們將CRISPR基因激活劑和引導RNA庫引入干細胞，以便每個(gè)細胞僅接受單個(gè)引導RNA，因此打開(kāi)了其特定的相應轉錄因子基因靶標。然后，他們根據它們變成紅色的方式對細胞進(jìn)行分類(lèi)，并在多和少的紅細胞中對指導RNA進(jìn)行測序，從而告訴他們哪些基因打開(kāi)后會(huì )使細胞或多或少地具有神經(jīng)元的功能。
當他們分析了由引導RNA改造的干細胞的基因表達時(shí)，結果表明相應的細胞產(chǎn)生了更特異性和更成熟的神經(jīng)元類(lèi)型。他們還發(fā)現了同時(shí)靶向時(shí)共同起作用的基因。此外，實(shí)驗揭示了拮抗干細胞神經(jīng)元功能的因素，當他們使用基于CRISPR的那些基因的阻遏物時(shí)，它們也可以增強神經(jīng)元的規格。
但是，這些結果都只是在測量神經(jīng)元標記。要知道這些工程細胞是否確實(shí)能重現更多成熟神經(jīng)元的功能，就需要測試其傳輸電信號的能力。
為此，他們求助于Scott Soderling教授，George Barth Geller分子生物學(xué)研究杰出教授和杜克大學(xué)細胞生物學(xué)系主任。Soderling實(shí)驗室的研究生Shataakshi Dube使用一種稱(chēng)為膜片鉗電生理的技術(shù)來(lái)測量新形成的神經(jīng)元內部的電信號。通過(guò)用非常小的移液管在細胞中戳一個(gè)小孔，她可以看到神經(jīng)元內部，看看它是否正在傳輸稱(chēng)為動(dòng)作電位的電信號。如果是這樣，研究小組就知道神經(jīng)元細胞已經(jīng)成熟。實(shí)際上，為激活特定的一對轉錄因子基因而設計的神經(jīng)元在功能上更成熟，更頻繁地發(fā)出更多的動(dòng)作電位。
杜貝說(shuō)：“我對這些干細胞如何變成神經(jīng)元感到好奇，但對此表示懷疑，但是，看到這些程序化細胞看起來(lái)像正常神經(jīng)元的程度令人驚訝。”
從干細胞到成熟神經(jīng)元細胞的過(guò)程耗時(shí)7天，與其他耗時(shí)數周或數月的方法相比，大大縮短了時(shí)間。更快的時(shí)間表可能會(huì )較大地加快神經(jīng)疾病新療法的開(kāi)發(fā)和測試。
創(chuàng )建更好的細胞將以多種方式幫助研究人員。像阿爾茨海默氏病，帕金森氏病和精神分裂癥這樣的疾病常見(jiàn)于成年人，并且難以研究，因為在實(shí)驗室中選擇合適的細胞具有挑戰性。這種新方法可以使研究人員更好地模擬這些疾病和其他疾病。它也可以幫助進(jìn)行藥物篩選，因為不同的細胞對藥物的反應不同。
更廣泛地講，用于篩選轉錄因子基因和基因網(wǎng)絡(luò )的相同方法可用于改進(jìn)制備任何細胞類(lèi)型的方法，這對于再生醫學(xué)和細胞療法可能是可轉化的。
例如，Gersbach的小組報告了一種使用基于CRISPR的基因激活將人類(lèi)干細胞轉化為肌肉祖細胞的方法，這種方法可以在今年早些時(shí)候再生受損的骨骼肌組織。
格斯巴赫說(shuō)：“這項工作的關(guān)鍵是開(kāi)發(fā)利用基于CRISPR的DNA靶向的能力和可擴展性的方法，將任何功能編程到任何細胞類(lèi)型中。” “通過(guò)利用已經(jīng)在我們的基因組中編碼的基因網(wǎng)絡(luò )，我們對細胞生物學(xué)的控制得到了較大的改善。”
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