細胞培養之：培養細胞的生長(cháng)和增殖過(guò)程

體內細胞生長(cháng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養細胞的生存環(huán)境是培養瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新?tīng)I養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過(guò)程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細胞的生長(cháng)和增殖過(guò)程都會(huì )受一定的影響。另外，很多細胞特別是正常細胞，在體外的生存也不是無(wú)限的，存在著(zhù)一個(gè)發(fā)展過(guò)程。所有這一切，使組織細胞在培養中有著(zhù)一系列與體內不同的生存特點(diǎn)。

（一）培養細胞生命期（Life Span of Culture Cells）

所謂培養細胞生命期，是指細胞在培養中持續增殖和生長(cháng)的時(shí)間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。組織和細胞在培養中生命期如何？這要看細胞的種類(lèi)、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細胞培養，在不凍存和反復傳代條件下，可傳30～50代，相當于150～300個(gè)細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時(shí)間，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短；如培養的為其它細胞如肝細胞或腎細胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉化時(shí)，細胞的生存期才可能發(fā)生改變。對此以后將詳述。

正常細胞培養時(shí)，不論細胞的種類(lèi)和供體的年齡如何，在細胞全生存過(guò)程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：

1．原代培養期：（Primary Culture）

也稱(chēng)初代培養，即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段，一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細胞分裂，但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態(tài)結構和功能活動(dòng)上相似性大。細胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養基中進(jìn)行培養時(shí)，細胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細胞獨立生存性差?？寺⌒纬陕始醇毎罕幌♂尫稚⒊蓡蝹€(gè)細胞進(jìn)行培養時(shí)，形成細胞小群（克?。┑陌俜謹?。初代培養細胞多呈二倍體核型；由于原代培養細胞和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實(shí)驗對象。

2．傳代期：

初代培養細胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續時(shí)間最長(cháng)。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱(chēng)二倍體細胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至*停止，細胞進(jìn)入第三期。

3．衰退期：

此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化（Spontaneous Transformation）。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱(chēng)不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱(chēng)無(wú)限細胞系（Infinite Cell Line），也稱(chēng)連續細胞系（Continuous Cell Line）。在早期文獻中無(wú)限細胞系也稱(chēng)已建立細胞系（Established Cell Line），現已不用。無(wú)限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉化亦可用人工方法誘發(fā)，轉化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。

（二）組織培養細胞一代生存期

所有體外培養細胞，包括初代培養及各種細胞系，當生長(cháng)達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質(zhì)、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關(guān)。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下，細胞數量增加與飽和速度相對要快（實(shí)際上細胞接種數量大時(shí)細胞增殖速度比稀少時(shí)要快）。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快，培養液中血清含量多時(shí)細胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì )縮短傳代時(shí)間。

所謂細胞“一代"一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養工作中的一種習慣說(shuō)法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：

1．潛伏期（Latent Phase）：

細胞接種培養后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著(zhù)是細胞附著(zhù)或貼附于底物表面上，稱(chēng)貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類(lèi)、培養基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養細胞貼附慢，可長(cháng)達10～24小時(shí)或更多；連續細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個(gè)非常復雜和與多種因素相關(guān)的過(guò)程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附。另外在貼附過(guò)程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱(chēng)LETS（Larger External Transformation Substance），細胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過(guò)程。這些物質(zhì)都是蛋白類(lèi)成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如 CSP），有的則來(lái)自培養基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類(lèi)細胞生長(cháng)增殖條件之一。

細胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細胞，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(cháng)和增殖期。細胞處在潛伏期時(shí)，可有運動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類(lèi)和培養基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養細胞潛伏期長(cháng)，約24～96小時(shí)或更長(cháng)，連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當細胞分裂相開(kāi)始出現并逐漸增多時(shí)，標志細胞已進(jìn)入指數增生期。

2．指數增生期（Logarithmic growth Phase）：

這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長(cháng)旺盛與否的一個(gè)重要標志。一般以細胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個(gè)細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數受細胞種類(lèi)、培養液成分、pH、培養箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數低，連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%～5%。pH和培養液血清含量變動(dòng)對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力很好的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗很好的和最主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續3～5天后，隨細胞數量不斷增多、生長(cháng)空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動(dòng)，這種現象稱(chēng)接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細胞則無(wú)接觸抑制現象，因此接觸抑制可作為區別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無(wú)接觸抑制能繼續移動(dòng)和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（Piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養充分，細胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進(jìn)一步增大，培養液中營(yíng)養成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細胞因營(yíng)養的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念，不應混淆。

3．停滯期（Stagnate Phase）：

細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細胞數量不再增加，故也稱(chēng)平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養液中營(yíng)養漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養即傳代，否則細胞會(huì )中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過(guò)晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過(guò)換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。結果反而耽誤了時(shí)間，這是在實(shí)驗中應特別注意的。

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