如何檢測你的細胞是否收到支原體的入侵呢？

細胞培養被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題，在細胞培養中支原體感染發(fā)生率達到63%。支原體是一類(lèi)無(wú)細胞壁，形態(tài)呈高度多形性，為圓形、絲狀或梨形，其直徑僅有0.13～0.18μm，變形能力大，故能通過(guò)濾菌器，突出的結構特征是沒(méi)有細胞壁，對作用于細胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明，支原體能耗盡營(yíng)養物，促進(jìn)代謝積累，導致pH改變，對細胞造成多種影響，包括生長(cháng)狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細胞存活等多方面的改變，繼而干擾實(shí)驗結果，或造成無(wú)法解釋的差異。更加不幸的是拯救被感染的細胞幾乎是不可能的。

那如何檢測你的細胞是否收到支原體的入侵呢？下面介紹了幾種檢測方式，或許對你的實(shí)驗有用。

分離培養法

分離培養法是支原體檢測的金標方法，其檢測精確度*高。這種方法是從可疑的細胞培養體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長(cháng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì )在這種瓊脂平板上生長(cháng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。分離培養法基本不會(huì )出現假陰性結果，因此被譽(yù)為支原體檢測金標準。

但是，分離培養法也存在兩個(gè)弊端，一是檢測時(shí)間太長(cháng)，支原體要長(cháng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。二是盡管可以檢測絕大多數支原體種類(lèi)，分離培養法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. hyorhinis。

DNA檢測法，也稱(chēng)直接培養法

將可疑樣品與指示細胞共同培養，一般需要幾天時(shí)間。DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質(zhì)區域較大的Vero細胞，如果原樣本中含有支原體，那么當細胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細胞的核周?chē)^(guān)察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。

但是這種方法靈敏度太低，當檢測成陽(yáng)性時(shí)，細胞經(jīng)常已經(jīng)嚴重污染。且Hoechst熒光染色：操作復雜，操作不當易造成假陽(yáng)性或假陰性。

PCR法

市面上有許多商機提供基于PCR的支原體檢測試劑盒，如GeneCopoeia。這種方法已經(jīng)比較成熟，應用的范圍也較為廣泛。

PCR法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其PCR引物可特異擴增支原體基因組中rDNA保守序列，包括所有已知的支原體，及細胞培養過(guò)程普遍遇到的種屬，例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium 和U. urealyticum。在凝膠電泳過(guò)程中，支原體DNA會(huì )顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。

PCR法快速，簡(jiǎn)便，具有強擴增能力和很高的敏感性，可以檢測大多數支原體，但謹慎起見(jiàn)最好同時(shí)使用另一種檢測方法來(lái)進(jìn)行驗證。PCR法檢測支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測方法。

酶學(xué)檢測

酶學(xué)檢測是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內支原體的酶可以將ADP轉化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。

最后，建議你進(jìn)行定期檢測

支原體感染會(huì )影響細胞的正常生長(cháng)，因此對培養細胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來(lái)說(shuō)每1至3個(gè)月就應該進(jìn)行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規化堅持下去，是細胞培養實(shí)驗室應對支原體感染的關(guān)鍵。

通常來(lái)說(shuō)，被污染的細胞應該丟棄，以避免成為污染源。但對于珍貴的細胞，以往別的品牌的支原體清除劑，其實(shí)只是抑制劑，它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成，但無(wú)法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌，可與支原體膜特異性結合，破壞膜通透性，導致支原體膨脹破裂而死。