文獻分享：如何為細胞挑選合適的血清？

牛血清是重要的細胞培養添加成分，具有終止胰蛋白酶消化，提供細胞生長(cháng)所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其他營(yíng)養物質(zhì)的作用。

根據采血時(shí)間的不同，牛血清通常分為：

• 胎牛血清（采自5-8月胎齡）

• 新生牛血清（采自出生0-7天內，也有說(shuō)法是0-30天內）

• 小牛血清（采自出生30天-1年）

• 成牛血清（采自成牛）

理論上，優(yōu)質(zhì)的胎牛血清在細胞培養方面通常優(yōu)于其他類(lèi)型的血清， 與新生牛和小牛血清相比，各類(lèi)生長(cháng)因子含量更為豐富，且由于5-8月胎牛沒(méi)有形成完整的補體系統，因此在使用的時(shí)候無(wú)需熱滅活。

但是由于胎牛血清價(jià)格相對而言會(huì )更高一些，不同實(shí)驗對于血清的需求也不同，因此，如何挑選適合自己實(shí)驗的血清就顯得尤為重要。總的原則就是，綜合考慮各實(shí)驗室、生產(chǎn)企業(yè)的條件與所培養細胞類(lèi)型。除了以往根據經(jīng)驗和文獻報道，必要時(shí)也可進(jìn)行針對特定細胞的血清篩選試驗，以篩選出最佳血清。

今天我們來(lái)分享一篇國內研究人員發(fā)表在《生物學(xué)雜志》上的標題為《不同類(lèi)型牛血清對MDCK細胞培養效果研究》的文獻，該研究對進(jìn)口胎牛血清、國產(chǎn)胎牛血清、國產(chǎn)新生牛血清在MDCK 細胞培養過(guò)程中的促生長(cháng)效果進(jìn)行了闡述。

研究方法

作者在含10%不同類(lèi)型牛血清的DMEM 培養液中連續傳代培養MDCK 細胞，比較了三種血清培養MDCK細胞的傳代穩定性、最大増殖密度、倍增時(shí)間、比生長(cháng)速率、貼壁率等指標。

1、貼壁培養傳代穩定性觀(guān)察

分別用含有10%A、B、C血清的DMEM培養基復蘇MDCK工作庫細胞，待細胞生長(cháng)至致密單層時(shí)，分別用含有3種類(lèi)型血清的DMEM培養基培養并連續傳代10代，傳代時(shí)細胞均按照1∶6比例，置于5%CO2、37 ℃培養箱中。每代細胞在24和48 h拍照觀(guān)察細胞形態(tài)、長(cháng)勢及致密程度。

2、生長(cháng)曲線(xiàn)及生長(cháng)動(dòng)力學(xué)分析

取第4代3種類(lèi)型血清培養生長(cháng)狀態(tài)良好且鋪滿(mǎn)單層的MDCK細胞，計數稀釋至1×10^4 個(gè)/mL，接種于24孔細胞培養板，每孔接1 mL細胞懸液。將24孔細胞培養板放置5%CO2、37 ℃培養箱中進(jìn)行培養，每24 h消化3孔計數，計算平均值。按照此方法，對培養至第6代、第9代的MDCK細胞重復該試驗2次，計算3次平均值,繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。并比較3種類(lèi)型血清培養MDCK細胞的最大増殖密度、倍增時(shí)間、比生長(cháng)速率和平均比生長(cháng)速率。

3、貼壁率分析

取第4代、第6代和第9代3種類(lèi)型血清培養生長(cháng)狀態(tài)良好且鋪滿(mǎn)單層的MDCK細胞，按1.2.1所述方法將細胞稀釋至1×10^3個(gè)/mL，制成50 cells/4 mL的細胞懸液，在6孔細胞培養板中每孔加入4 mL的細胞懸液，并做平行3孔。將6孔細胞培養板放置5%CO2、37 ℃培養箱中培養8 d，出現集落后，用吸管吸去培養液，用PBS清洗，無(wú)水甲醇固定，結晶紫染色。觀(guān)察并對細胞集落計數,計算平均值。

4、細胞工廠(chǎng)擴大培養驗證

取第10代C血清培養生長(cháng)狀態(tài)良好且鋪滿(mǎn)單層的MDCK細胞，消化后計數，擴大培養至1層細胞工廠(chǎng)連續傳3代，加150 mL細胞培養液,接種密度為(8～9)×10^4 個(gè)/mL，置5%CO2、37 ℃培養箱，用上述方法，接種10層細胞工廠(chǎng)，加1.5 L細胞培養液,接種密度為(8～9)×10^4個(gè)/mL，每12 h用細胞工廠(chǎng)觀(guān)察臺觀(guān)察,待細胞長(cháng)成致密單層后，繼續傳代培養3代，觀(guān)察細胞生長(cháng)情況并在長(cháng)成致密單層時(shí)消化計數。

實(shí)驗結果

• 在最大增殖密度和倍增時(shí)間上，胎牛血清均優(yōu)于新生牛血清。

• 在貼壁率方面［貼壁率(% ) = (所形成集落數/ 接種細胞數) ×100%］，進(jìn)口胎牛血清略高于國產(chǎn)胎牛血清，差異顯著(zhù)；國產(chǎn)新生牛血清低于國產(chǎn)和進(jìn)口胎牛血清，差異極顯著(zhù)。

總結

對于生產(chǎn)或研究所用的培養細胞，大多數情況下，生產(chǎn)或研究人員可以依據以往經(jīng)驗以及文獻報道選擇合適的血清。在個(gè)別不確定的情況下，也可參考以上文章的方法進(jìn)行最適血清的篩選。

參考文獻：

[1]李自良,王家敏,趙彩紅,王美皓,李倬,喬自林,馬忠仁.不同類(lèi)型牛血清對MDCK細胞培養效果研究[J].生物學(xué)雜志,2020,37(04):21-25.

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