細胞培養實(shí)戰

細胞培養的本質(zhì)是細胞克隆技術(shù)。原理就是盡可能給細胞提供類(lèi)似于體內的環(huán)境，在無(wú)菌條件下，給予適當的溫度和酸堿度以及細胞生長(cháng)繁殖所必要的營(yíng)養條件，使其能在體外維持正常的生長(cháng)繁殖，并保持其結構和功能的技術(shù)。

細胞培養技術(shù)的應用十分廣泛，基礎醫學(xué)研究，抗體制備，新藥篩選，基因工程等等都需要用到細胞培養技術(shù)。

但在日常的細胞實(shí)驗中，實(shí)驗者經(jīng)常會(huì )遇到一些問(wèn)題，今天我們就這些常見(jiàn)的問(wèn)題給出相應的建議，希望對小伙伴們有所幫助。

貼壁細胞如何高效傳代？

貼壁生長(cháng)的細胞，在培養瓶或者培養皿長(cháng)至單層鋪滿(mǎn)的狀態(tài)后后，空間已基本上飽和，細胞生長(cháng)、增殖受阻，為使其繼續擴增或生長(cháng)，需要進(jìn)行傳代（再培養）處理。同時(shí)，傳代培養也可用于細胞種的保存。不僅如此，各種細胞實(shí)驗也是以高效的細胞傳代為基礎的。

懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞則需經(jīng)消化等處理后才能分瓶。

一般使用胰蛋白酶，將貼壁細胞消化成成單個(gè)細胞，也可加入EDTA提高消化能力（EDTA 是一種二價(jià)離子的螯合劑，能抑制細胞膜上的Ca2+和Mg2+）。

常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA。

實(shí)驗時(shí)，先用吸去細胞培養上清，用PBS清洗細胞，棄掉洗滌液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(根據培養皿的大小不同，一般2-5ml消化液即可，以剛好鋪滿(mǎn)整個(gè)皿底為原則)，觀(guān)察細胞直到細胞變圓脫離瓶壁，此過(guò)程一般需要3-5分鐘，為了避免細胞成團，消化細胞的過(guò)程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進(jìn)消化，細胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的*培養基中止消化。

800-1000rpm，離心5分鐘，然后棄去中止用的培養基，加入適合的新的培養基輕輕混勻細胞，移入到新的培養瓶。傳代的比例視細胞類(lèi)型而定。胰蛋白酶會(huì )對某些細胞的細胞膜產(chǎn)生損傷，對于這種類(lèi)型的細胞，可用細胞刮輕輕刮下細胞，加入適量的培養基，輕輕吹打混勻細胞，然后進(jìn)行傳代培養。

細胞傳代的頻率為多久？

貼壁型的細胞的匯合度約為100%的時(shí)候，需進(jìn)行傳代操作。

當細胞以克隆的形式生長(cháng)時(shí)，匯合度則達不到100%。對于該類(lèi)型的細胞，達到或者接近最大密度的時(shí)候，即觀(guān)察不到細胞明顯擴增時(shí)，就需要進(jìn)行傳代。

接觸抑制型細胞需要在細胞長(cháng)滿(mǎn)之前傳代，避免產(chǎn)生細胞長(cháng)滿(mǎn)后接觸抑制后產(chǎn)生性狀的改變。

懸浮型的細胞必須在細胞達到最大飽和密度之前傳代，懸浮細胞傳代時(shí)只需稀釋至合適的密度，讓細胞有充足的營(yíng)養恢復到對數生長(cháng)期。

如何處理腫瘤細胞株？

了解每株細胞可能產(chǎn)生的生物危害是很難的。

• 強烈推薦，所有的人類(lèi)和其他靈長(cháng)類(lèi)生物的細胞在預防HIV和肝炎病毒的實(shí)驗條件下操作；

• 所有的操作必須在生物安全柜中操作，遵守生物安全柜使用規范；

• 操作過(guò)程中產(chǎn)生的廢液和廢儀器都要經(jīng)過(guò)清洗、酸處理等處理后才能丟棄。