您了解核酸法驗證中支原體標準品嗎？

什么是支原體核酸法

支原體核酸法包括PCR和qPCR，通過(guò)檢測支原體的特異核酸序列，以確定細胞上清或生物制品中是否存在支原體污染的一種方法。

由于支原體核酸法具有檢測時(shí)間短（只需3-4h）、操作便捷等特點(diǎn)，越來(lái)越受到生物制品企業(yè)的青睞。

支原體核酸法可作為藥典規定的培養法或DNA染色法的替代方法，或與以上方法相互補充。

事實(shí)上，早在2011年，就有動(dòng)物疫苗廠(chǎng)家在2011年第5期的《廣東農業(yè)科學(xué)》上，報道了用德國Minerva Biolabs（簡(jiǎn)稱(chēng)MB）公司的支原體PCR試劑盒，用于檢測疫苗中是否存在支原體的污染，它可與培養法互為補充，共同用于生產(chǎn)，為生產(chǎn)提供可靠的數據支持。

支原體標準品

方法驗證

支原體核酸法在用于放行檢測之前，需先進(jìn)行方法驗證。歐洲藥典和日本藥典均要求核酸法需要在靈敏度、特異性和耐用性三個(gè)指標方面達到要求。

在靈敏度方面（又稱(chēng)最di檢測限），要求核酸法替代培養法，則靈敏度需達到10CFU/ml；核酸法替代DNA染色法，則靈敏度需達到100CFU/ml。

在特異性方面，歐洲藥典和日本藥典要求，核酸法要識別指ding的常見(jiàn)9種支原體，而不識別與支原體有近緣關(guān)系的菌屬，如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳桿菌和肺炎鏈球菌，也不識別其他細菌和哺乳動(dòng)物DNA。

在耐用性方面，歐洲藥典要求檢測結果不受方法參數的小的偏差的影響，如濃度的變化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步驟的細微差別等。實(shí)際上這是強調結果的可靠性和穩定性，不受人為操作誤差的影響。這可通過(guò)3輪不同時(shí)間段內的檢測來(lái)實(shí)現，每輪進(jìn)行8次重復檢測，最后觀(guān)察結果有什么變化。

在進(jìn)行方法驗證時(shí)，參比標準品是bi不可少的。著(zhù)名微生物防控專(zhuān)家德國MB公司提供有一系列的支原體標準品和支原體DNA標準品，用于支原體核酸法的方法學(xué)驗證。

支原體標準品

Minerva Biolabs標準品

MB提供的標準品有三類(lèi)：

靈敏度標準品

同時(shí)也用于耐用性驗證。該標準品為凍干粉型的滅活支原體，這樣不會(huì )造成實(shí)驗室污染。原支原體來(lái)自英國NCTC菌種保藏中心，由于傳代次數低，也很少發(fā)生突變。支原體經(jīng)標準定量，有10CFU/管和100CFU/管可選。使用時(shí)用1ml與待測樣本同樣的基質(zhì)液去溶解。之后進(jìn)行支原體DNA抽提，再進(jìn)行核酸法檢測。如結果陽(yáng)性，則表明最di檢測限能達到上述標準。

特異性驗證用標準品

它包括支原體基因組DNA以及細菌基因組DNA，種屬經(jīng)測序驗證。該標準品為10ng左右包裝，為凍干粉型。用于PCR和qPCR方法對支原體物種的特異性檢查,每種支原體DNA經(jīng)測序驗證，濃度經(jīng)滴度測定。

PCR定量標準品

該標準品是經(jīng)過(guò)嚴格定量的支原體DNA標準品，每管支原體基因組DNA的量為1×10^8基因組拷貝，用于10倍梯度稀釋制備標準曲線(xiàn)，以對核酸法（主要是qPCR）的檢測限進(jìn)行精確定量，并可驗證標準品濃度對數與Ct值的線(xiàn)性關(guān)系。

值得指出的是，歐洲藥典和日本藥典均要求先進(jìn)行支原體DNA抽提，再進(jìn)行核酸法檢測。因此，方法驗證實(shí)際上包括了核酸法的這兩部分。

對于生物制品、細胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)，在選用已經(jīng)過(guò)廠(chǎng)家全面驗證的支原體檢測試劑盒之外，還需自己按照待測樣本類(lèi)型進(jìn)行方法的適用性驗證。

試劑盒的驗證并不能代替包括操作過(guò)程在內的方法的適用性，操作、樣本基質(zhì)和儀器同樣會(huì )對核酸法的技術(shù)指標產(chǎn)生不可忽視的影響。因此“對癥下藥"就顯得尤為重要了。