干細胞標準培養方法是什么？

干細胞是一類(lèi)具有無(wú)限的或者永生的自我更新能力的細胞、能夠產(chǎn)生至少一種類(lèi)型的、高度分化的子代細胞[1]。

干細胞被認為可以提供一種理想的生物學(xué)平臺, 用于多方面的科學(xué)研究與臨床應用, 如藥物篩選平臺的建立、細胞發(fā)育與分化的分子調節機制研究、基因靶向敲除動(dòng)物模型的構建、組織工程種子細胞及基因治療載體的建立、細胞治療及再生醫學(xué)等[2]。

干細胞研究離不開(kāi)干細胞的培養。合格的干細胞培養的過(guò)程，包括促進(jìn)其分裂增殖和維持其未分化狀態(tài)。

基于以上兩點(diǎn)要求，目前主流的標準培養方法為飼養層培養法：

即在有絲分裂失活的飼養層細胞 (FEEDER) 上培養干細胞。培養體系一般為高糖DMEM，添加適量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加劑。

另外，為了避免外源性物質(zhì)的干擾（如血清、病原等成分）[3]，又嘗試及建立了其他培養基, 包括條件培養基 (CM) 、無(wú)飼養層、無(wú)血清、血清替代物 (SR) 非條件培養基等。

其中無(wú)血清培養基中添加了更多珍貴的細胞因子，而血清替代物培養基則采用人工/半人工合成分子替代物的形式，來(lái)替代血清，成本相較于普通胎牛血清*培養基而言，高出不少。

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飼養層培養法

目前認為，飼養層能夠提供干細胞接觸所必需的復雜蛋白分子。自1981年EVANS等人[4]用飼養層成功培養了mESC起，飼養層培養法便開(kāi)始不斷發(fā)展。實(shí)驗過(guò)程，主要分為以下三步：配制飼養層細胞培養基、準備飼養層細胞、配制飼養單層細胞培養基、飼養單層制備、配制干細胞培養基、接種干細胞培養。

飼養層培養法卻存在著(zhù)不可避免的缺點(diǎn)：

1、 飼養層細胞生命期有限，不能在體外長(cháng)期傳代。在體外傳代時(shí)間太長(cháng)，其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會(huì )減弱甚至喪失。

2、 MEF細胞的染色體干擾：飼養層細胞會(huì )影響干細胞遺傳物質(zhì)?！?/p>

3、 絲lie霉素-C的影響：飼養層細胞需要用到絲lie霉素-C，該物質(zhì)可能會(huì )影響干細胞的增殖。

4、 異種抗原及污染的影響：飼養層細胞作為異種抗原也會(huì )影響干細胞的健康，還有發(fā)生細胞間融、引入其他動(dòng)物源性病原體，給臨床移植治療帶來(lái)風(fēng)險。

5、 所用試劑復雜，批次不可控：所用材料的批次之間的波動(dòng)，限制了培養物之間的可重復性。

6、 實(shí)驗周期長(cháng)，培養基配制復雜：在基礎培養基的基礎上，添加例如白血病抑制因子（LIF）[6]這樣的多功能細胞因子，但無(wú)論進(jìn)口還是國產(chǎn)的產(chǎn)品，都不免有價(jià)格高昂的缺點(diǎn)。而自己配制，又會(huì )面臨操作繁瑣、易污染等問(wèn)題。飼養層培養從培養飼養細胞開(kāi)始，至少需要一周時(shí)間才能得到所需的干細胞，周期過(guò)長(cháng)。

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無(wú)飼養層培養

無(wú)飼養層培養類(lèi)似普通細胞培養，主要分為以下幾個(gè)步驟：培養瓶預處理、配制培養基、消化/復蘇干細胞、接種、培養。

相較于飼養層培養法，無(wú)飼養層培養法的優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)：更加簡(jiǎn)便、節省時(shí)間；但缺點(diǎn)也十分明顯：

1、 培養的細胞質(zhì)量不穩定：由于自行配制的培養基，不可控因素較多，缺少營(yíng)養細胞對的存在，干細胞生長(cháng)狀況也不穩定，直接影響實(shí)驗結果。

2、 成本高昂：商品化的培養基，根據品質(zhì)不同，價(jià)格也是從幾百元到幾千元不等，直接增加了干細胞的培養成本。

3、 需要不斷對培養基進(jìn)行調整，對實(shí)驗人員有很高的要求：無(wú)飼養層培養法需要人為添加各種各樣的細胞因子，不同的干細胞還需要進(jìn)行細微的調整以適應不同的生長(cháng)需求，因此培養難度更高，對技術(shù)人員的操作水平及經(jīng)驗有很高的要求