珍貴細胞被支原體污染了怎么辦？

一般細胞遇到支原體污染時(shí)，應立即丟棄，以避免成為污染源。但對于非常珍貴的細胞、不易獲得的生物樣本或細胞種子，遇到支原體污染，希望挽救而不能丟棄時(shí)，應怎么辦呢？

這里向您推薦支原體*清除法——使用德國MB公司生產(chǎn)的Mynox® Gold，直接殺除支原體并在細胞培養三代過(guò)程中鞏固防護，即可*清除細胞中的支原體。

支原體污染祛除劑——Mynox® Gold（細胞保種用）

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產(chǎn)品信息

（生產(chǎn)商：德國MB公司）

每套Mynox® Gold支原體祛除劑

包括：

1管 首ci治療液Mynox®

3管 鞏固防護液

推薦使用范圍：研究用

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產(chǎn)品特點(diǎn)：　

1.支原體祛除有效率接近100%。

2. 適合所有細胞類(lèi)型， 包括永生細胞（如Vero, BHK21, GBK, ML, Hep2, CRFK, H9, Molt4, MT-4, Jurkat）、原代細胞和干細胞。

3. 無(wú)細胞毒性。用Mynox® Gold處理細胞時(shí)，大多數類(lèi)型細胞沒(méi)有形態(tài)變化。

4. 低耐藥風(fēng)險。主要采用生物物理學(xué)方法直接清除支原體。

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工作原理

【首ci治療液Mynox®】是一款直接殺除支原體的試劑。

它來(lái)自枯草桿菌提取物，可特異性地與支原體膜結合，改變支原體膜通透性，從而使支原體在2-3小時(shí)內破潰死亡（下圖）。

【鞏固防護液】加入培養基，后續培養一個(gè)月，將會(huì )*清除細胞中的支原體污染，確切有效（3管「鞏固防護液」可傳3代）。

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使用方法

實(shí)驗所需耗材：25cm2細胞培養瓶或60 mm 培養皿

支原體消除結果評估：采用支原體檢測試劑盒如Venor®GeM系列。

具體操作步驟如下（超凈臺內操作）：

01

制備“首ci治療混合液"

1）吸量管吸取4.5ml含5%胎牛血清的細胞培養基，加入到無(wú)菌的15ml離心管中。再加入500 µl Mynox ® Gold首ci治療液（橘黃色蓋）。

2）將15ml離心管內的培養基和Mynox® Gold首ci治療液混勻。

3）將15ml離心管內的混合液（5ml）轉移至無(wú)菌的25cm2細胞培養瓶或60 mm 培養皿中。

02

加入細胞

按細胞正常傳代來(lái)操作。對于貼壁細胞，使用胰酶將細胞解離打散。

1）注意：顯微鏡下觀(guān)察，確保為單細胞懸液，無(wú)細胞成團。

2）吸量管吸取5ml單細胞懸液（含104–105細胞，細胞培養基含5%胎牛血清），加入到上述的“首ci治療混合液"中。此時(shí)總體積為10ml。

注意：加入細胞時(shí)，吸頭插入到液面下，以避免產(chǎn)生氣溶膠。吸頭不要觸及培養瓶/皿的內壁。

3）輕輕搖晃培養瓶/皿，以避免細胞分布不均。將細胞轉至孵箱正常培養。

03

主要治療

1）細胞長(cháng)至80~90%匯合。

2）細胞正常傳代。取9.5ml已加新鮮培養基的細胞，加到無(wú)菌培養瓶或培養皿中。再加入500 µl Mynox® Gold鞏固防護液（透明管蓋）。調整胎牛血清濃度，不再將其濃度再保持在5%，可恢復正常濃度。

3）加入鞏固防護液的細胞繼續培養，再重復以上步驟2次（采用Mynox® Gold鞏固防護液治療2次）。第3次鞏固防護液治療后，支原體即*去除（細胞總共傳了4代）

04

支原體殘留的檢測

支原體被Mynox®裂解后會(huì )釋放DNA到培養基中，此時(shí)檢測支原體會(huì )導致假陽(yáng)性。應在正常培養四代后檢測支原體。培養基更換和使用外源DNA酶可在1-2代內降低游離的支原體DNA。

建議采用高靈敏度的Venor® GeM支原體檢測試劑盒檢查支原體。

注意：

a) 做支原體清除時(shí)，一次治療的細胞數不要超過(guò)105。

b) Mynox® Gold的支原體殺除活性受到反應混合液中的脂質(zhì)和蛋白濃度的影響。在步驟1和步驟3中，與「首ci治療液」配合使用的培養基，FBS濃度均為5%，不要濃度過(guò)高。從步驟5開(kāi)始，與「鞏固防護液」配合使用的培養基，其中FBS的濃度則恢復為原來(lái)正常使用的濃度。

c) Mynox® Gold通過(guò)和支原體膜直接接觸而產(chǎn)生殺滅效應。應避免細胞成團，否則支原體可能躲在細胞間隙中，影響祛除率