讓細胞告別支原體污染的方法在這里

養細胞的小伙伴，最怕遇到的，大概就是細胞污染了。

這細菌和真菌污染好辨別，處理起來(lái)雖然麻煩，但也不是毫無(wú)辦法。相比起來(lái)，支原體污染才是防不勝防。

顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細胞共存在同一培養體系下，還跟細胞搶吃搶喝?？蓱z弱小又無(wú)助的細胞根本不是支原體的對手，只能茍延殘喘，狀態(tài)一代不如一代，導致實(shí)驗結果出現偏差。

多數情況下，發(fā)現細胞疑似支原體污染，直接丟掉然后清理環(huán)境即可。但在一些特殊實(shí)驗，比如：細胞保種、抗體藥生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)或是細胞治療過(guò)程中，則需要對細胞例行支原體檢測，以確保細胞的純凈。

支原體常規檢測法之經(jīng)典法

這里指的是基于經(jīng)典法試劑盒：Venor®Gem qEP的檢測方法。

關(guān)于qPCR大家應該都不陌生：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Quantitative Real-time PCR

是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

在支原體經(jīng)典法檢測試劑盒中，無(wú)需RNA提取和反轉錄步驟，樣品僅需待檢測的細胞上清或是從上清中提取的DNA。

經(jīng)典法試劑盒：Venor®Gem qEP使用方法

一、樣品制備：

①濃縮：當細胞長(cháng)至90%時(shí)，即可收集上清開(kāi)始檢測，可對樣品進(jìn)行適當濃縮。

注：濃縮僅適用于支原體的完整性，避免濃縮前支原體被破壞（如熱滅活）。

②穩定：細胞培養樣品可能含有豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩定化處理。如果立即進(jìn)行DNA抽提，則忽略這一步。

③DNA 抽提：大量證據表明，DNA抽提可實(shí)現高的靈敏度。DNA抽提有多種方法，但應適合支原體基因組。我們推薦：

Venor®GeM Sample Preparation kits （貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動(dòng)DNA抽提

這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過(guò)大量驗證，具體流程參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。另外Venor®GeM qEP kit包含的內控DNA對照，也用于驗證DNA抽提步驟（內控原理：已知濃度的細胞，包含內部控制DNA序列，該序列不和現有的任何有機體序列同源，對檢測的DNA樣品干擾極小。在DNA提取前，將該內控細胞和樣品一起加入細胞裂解液中，被一起提取出來(lái)。和靶點(diǎn)樣品一起進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗，內控DNA序列的成功擴增提示靶點(diǎn)DNA的提取成功）。

二、試劑制備與PCR

另外，下列儀器已經(jīng)通過(guò)PCR反應驗證：

三、結果分析

FAM通道檢測支原體熒光信號。依據DNA標準曲線(xiàn)和Ct值定量。具體步驟需參考具體qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對包括對照在內的每個(gè)樣品的擴增曲線(xiàn)進(jìn)行評估。

Ct＜40為陽(yáng)性結果。Ct≥40為陰性結果。支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多，FAM通道信號越高，檢測內控對照的HEX通道信號越低。

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