大曝光！細胞消化的三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)

細胞消化是細胞培養過(guò)程中不可少的環(huán)節之一。細胞消化操作不當，容易改變細胞狀態(tài)，引起細胞實(shí)驗產(chǎn)生不必要的誤差，進(jìn)而影響實(shí)驗的重復性。

因此，正確合理的細胞消化操作，至關(guān)重要。

細胞消化小技巧

細胞潤洗次數

絕大部分細胞

用胰酶潤洗

一次即可

胰酶是一種蛋白酶，酶切位點(diǎn)是肽鏈的Lys或Arg兩個(gè)殘基的羧基端肽鏈，通過(guò)在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上與培養皿壁結合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時(shí)，細胞由于自身內部細胞骨架的張力以及培養液表面張力可成為球形。

由于在細胞培養中，胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。胰酶作用時(shí)間過(guò)長(cháng)、作用次數過(guò)多，都容易破壞細胞表面結構。

在吸去培養基后，用37℃預熱過(guò)的PBS潤洗細胞表面1-2次，隨后加入適量胰酶，以能夠平鋪在器皿底部一層，略蓋過(guò)細胞為原則，且潤洗一次即可?？煞湃?7℃培養箱中孵育1-2分鐘。

何時(shí)終止消化

貼壁細胞層

呈流沙狀可移動(dòng)

即可終止消化

有不少細胞培養人員，喜歡把全部細胞，消化成間隔分布很離散的單個(gè)圓形的細胞，但實(shí)際上，此時(shí)的細胞已經(jīng)處于“消化過(guò)度"的狀態(tài)了。

因此，肉眼觀(guān)察下，50%左右細胞呈現流沙狀，或鏡下觀(guān)察細胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，即可加入胰酶2-3倍體積的含血清培養基，終止消化。

血清可以終止胰酶對細胞的消化，也為細胞提供*營(yíng)養。選擇一款優(yōu)質(zhì)的胎牛血清，為細胞實(shí)驗提供保障。

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不用胰酶如何消化細胞

EDTA消化

或物理刮涂法

也可使細胞脫壁

只用EDTA，或者用胰酶-EDTA（Trypsin-EDTA）聯(lián)合作用，也可對細胞進(jìn)行消化。其中，胰酶切割ECM的一些負責粘連和附著(zhù)的蛋白，而EDTA通過(guò)螯合鈣離子，作用于整合素的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶中添加EDTA，可以對付特別難消化的細胞。

用細胞刮也可以對貼壁細胞進(jìn)行物理脫壁。使用時(shí)側拿培養器皿，用無(wú)菌細胞刮沿一個(gè)方向轉動(dòng)掛，集于底部，直至刮完每一個(gè)角落即可。

另外，需要注意的是，在做細胞凋亡檢測時(shí)，不適合用含有EDTA的胰酶，可以使用物理方法對細胞進(jìn)行脫壁處理。Annexin V常用于細胞凋亡檢測，是一種鈣離子依賴(lài)的蛋白，EDTA會(huì )螯合鈣離子從而影響Annexin V，進(jìn)而影響結果，因此需選用不含EDTA的胰酶。

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