細胞凍存『掃雷指南』，這些關(guān)鍵點(diǎn)必看！

細胞凍存

細胞凍存是細胞實(shí)驗中的一個(gè)常規步驟，是細胞保存的重要方法之一。將細胞低溫保存在-196℃液氮中，使細胞暫時(shí)脫離生長(cháng)狀態(tài)而進(jìn)入休眠階段，以便日后復蘇重新培養擴增。

細胞凍存方法

細胞凍存實(shí)驗，在往期文章中也有提到

保姆級細胞凍存方法

看似簡(jiǎn)單的實(shí)驗，仍有一些關(guān)鍵點(diǎn)需要格外留意，切莫踩到“雷區"，造成“實(shí)驗大翻車(chē)"。

凍存操作前：

選擇長(cháng)勢良好、存活率高，且生長(cháng)密度在80%—90%的細胞進(jìn)行凍存。

需對細胞進(jìn)行雜質(zhì)檢測：是否有雜細胞或者支原體等雜質(zhì)。

這里推薦使用MB支原體常規法PCR檢測試劑盒，非定量檢測，常規PCR即可滿(mǎn)足需求，方便快捷，靈敏度高。

所用凍存試劑DMSO應為分析級，避光儲存。

凍存前一日，對需保存的細胞進(jìn)行換液處理。

凍存操作

配制凍存培養基（常規含量）：DMSO含量5-10%，血清含量20%左右。

用凍存培養基將離心后的細胞進(jìn)行重懸。

分裝至無(wú)菌凍存管中。

梯度降溫：

4℃ 10 分鐘

?

-20℃ 30 分鐘

?

-80℃ 16～18 小時(shí)

?

液氮

或將裝有細胞的凍存管，置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱中，一天后轉移至液氮中。

液氮的液相儲存與氣相儲存

一般認為：-196℃的液氮，對于需要長(cháng)期保存的細胞而言，是一比較合適的環(huán)境。因此，我們會(huì )將裝有細胞的凍存管，放入專(zhuān)用的方形凍存盒中，再裝進(jìn)液氮罐配套的提籃提籃中，浸入液氮的液相中進(jìn)行保存。

但在液相中長(cháng)期儲存，容易面臨以下問(wèn)題：

如果凍存管在罐內密封不嚴，則會(huì )引起液氮滲入管內，灌滿(mǎn)整個(gè)樣品管，造成樣品的污染。不僅如此，在取出凍存管的時(shí)候，液氮沸騰氣化使管內氣壓升高，發(fā)生炸裂，容易傷到實(shí)驗人員。

因此，有人提出，可以將細胞置于液氮的氣相中進(jìn)行儲存。

液氮罐內溫度較比液相儲存高，一般在-135℃至-190℃，對于細胞儲存而言，該溫度也符合要求，但在實(shí)際操作過(guò)程中，也存在一定弊端：

與液相液氮罐相比，氣相液氮罐，在相同體積的液氮中保存時(shí)間更短，需對液氮罐內的溫度進(jìn)行監控，及時(shí)補充液氮來(lái)維持罐內溫度。

所以，應根據實(shí)驗環(huán)境、實(shí)驗條件等情況，合理選擇液相儲存或是氣相儲存。在正確操作的前提下，這兩者都能達到比較好的凍存效果