qPCR技術(shù)如何在『支原體檢測』中大顯神通？

無(wú)論是歐洲藥典、日本藥典、還是中國藥典，均對細胞相關(guān)的臨床項目有明確的支原體檢測指標的要求。藥典中還指出，核酸法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗證后，可替代傳統的培養法與指示細胞法進(jìn)行檢測。

PART.01

qPCR檢測支原體的技術(shù)原理

通過(guò)擴增高度保守的rRNA操縱子，或者更準確地說(shuō)，擴增支原體基因組中的16S rRNA編碼區，可以特異性地檢測支原體。在FAM通道檢測支原體特異性擴增片段。在HEX通道檢測內部擴增對照的擴增。它能特異性檢測所有導致細胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會(huì )被擴增。通過(guò)內部對照，可檢測PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結果。

樣本通常為細胞培養上清液，如檢測其他組織或細胞樣本，需要對樣本進(jìn)行額外的處理，例如蛋白酶消化等過(guò)程。檢測程序通?？稍?小時(shí)內完成。

PART.02

qPCR用于支原體檢測的優(yōu)勢

快速簡(jiǎn)便

與動(dòng)輒30天起步的傳統培養法相比，qPCR技術(shù)的反應時(shí)間相對較短，通常在幾小時(shí)內就可以完成，大大縮短了用于檢測對的時(shí)間成本。

靈敏度高

qPCR技術(shù)可以在非常低的病原體濃度下進(jìn)行檢測，這種高靈敏度使得qPCR能夠有效地檢測細胞培養體系、實(shí)驗或生產(chǎn)流程中，是否發(fā)生支原體污染，即使在污染的早期階段，也能夠得到準確的結果。

并且配合靈敏度標準品，進(jìn)行靈敏度的驗證，進(jìn)一步完善方法學(xué)驗證的流程。

以德國Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例，檢測限可達到≤10CFU/ml。

特異性強

qPCR技術(shù)可以使用特異性引物和探針來(lái)選擇性地擴增目標支原體的DNA序列。通過(guò)設計引物和探針與目標序列高度匹配，可以避免非特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高檢測的特異性。

以德國Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例，一次檢測即可涵蓋所有常見(jiàn)易感染細胞的支原體物種（包括歐洲藥典規定的9種支原體）。與細菌和真核DNA無(wú)交叉反應。

定量能力

與傳統的PCR技術(shù)相比，qPCR可以提供定量信息。通過(guò)利用熒光探針或DNA染料，可以實(shí)時(shí)監測PCR反應過(guò)程中的熒光信號強度，從而得到目標序列的定量結果。這種定量能力使得qPCR技術(shù)在支原體載量的測定和污染進(jìn)程的監測中非常有用。

PART.03

支原體檢測試劑盒

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒（均為探針?lè )z測）：Venor Gem qEP，有以下優(yōu)點(diǎn)：

①遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性。一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規定的9種支原體），根據序列一致性，至少可以檢測到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單，易于觀(guān)察（使用MB的試劑盒，多種支原體物種均為陽(yáng)性，其他微生物或真核細胞均為陰性，無(wú)交叉反應）。

③高靈敏度。MB公司的支原體qPCR檢測試劑盒經(jīng)典法檢測限可達到≤10CFU/ml。

④各類(lèi)標準品配套齊全

10CFU/100CFU的敏感度測試的標準品，便于方法學(xué)驗證。

支原體基因組DNA和細菌基因組DNA，便于特異性驗證。

支原體絕對定量標準品，便于最后定量檢測。