答疑解惑：CCU計數法與CFU定量法如何選擇？

CCU計數法和CFU定量法，是微生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究中，常用的方法。這兩種方法都可以用來(lái)測量微生物或細胞數量。具體應該選擇使用哪種方法，取決于研究的具體需求、樣品類(lèi)型，以及實(shí)驗條件的可控性。一般來(lái)說(shuō)，CFU定量法更為常用，它不僅提供數量信息，還提供了關(guān)于微生物或細胞活力的信息。

在制藥和臨床領(lǐng)域，支原體定量是采用CCU計數法。即用“顏色改變單位(CCU) "對支原體進(jìn)行定量。該方法主要是將支原體菌液10倍系列稀釋?zhuān)缓蠼臃N在含酚紅的支原體肉湯培養基中，36°C±1°C 培養7～14天。使培養基變色的最高菌液稀釋度定為1ccu/ml。

而在制藥領(lǐng)域，用PCR/qPCR方法對產(chǎn)品進(jìn)行支原體檢查時(shí)，要求檢測方法的檢測限達到10CFU/ml。CFU即菌落形成單位，它代表著(zhù)支原體在瓊脂培養基上的菌落數量，這是另外一種定量法。

這兩種定量法是否具有可比性？在2020年2月第4期的《衛生檢驗雜志》上，一篇名為《支原體菌落形成單位與顏色改變單位定量關(guān)系研究》的論文報告了兩種方法比較的結果。

在該研究中，作者用A8培養基培養解脲支原體（ATCC 33175）48小時(shí)，用支原體培養基培養人型支原體（ATCC 23114）72小時(shí)，用SP4培養基培養肺炎支原體（ATCC 29342）6天，然而觀(guān)察菌落的生長(cháng)情況。同時(shí)，作者將菌株凍干粉復溶后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)臃N到相應肉湯中。為降低誤差，作者對菌液采取了5倍系列稀釋?zhuān)?span>10倍。當培養至肉湯顏色不再變化時(shí)，最高稀釋倍數的菌液濃度即為1ccu/ml，然后根據稀釋倍數回算出菌液原液的濃度。

在進(jìn)行CFU計數時(shí)，作者發(fā)現，典型支原體菌落的直徑是15mm~300mm。其中，人型支原體和肺炎支原體的菌落可以肉眼識別，而解脲支原體的菌落直徑只有15mm~60mm，需要借助低倍顯微鏡才能看到并計數。

作者重復了10次，結果顯示，對于這3株支原體，CCU計數較為穩定，CFU計數則存在一定的波動(dòng)。對于解脲支原體，CCU與CFU二者的計量結果接近，無(wú)顯著(zhù)差異；而對于人型支原體和肺炎支原體，CFU計量數值略高于CCU計量數值，有顯著(zhù)差異。

由于支原體在肉湯生長(cháng)比瓊脂中要快，因此實(shí)際工作中CCU計數更為常見(jiàn)。作者認為，解脲支原體菌落較小，不容易計數，因而標準差較高。10倍稀釋對CCU計量的結果會(huì )造成一定誤差，因為實(shí)驗中培養基變色的最高稀釋度往往并不是能夠變色的最高稀釋度。降低稀釋倍數會(huì )減少誤差，但是會(huì )增加工作量。

在該實(shí)驗中，作者給出了三個(gè)菌株10次試驗的全部數據，因而可對CCU計數與CFU定量的結果進(jìn)行比較，明確二者之間的關(guān)系。

目前，在支原體檢查中，越來(lái)越多的藥廠(chǎng)采用PCR或qPCR方法。但該方法用于放行檢測時(shí)，需要進(jìn)行方法驗證，保證適用性。這是，常用到10CFUTM支原體靈敏度標準品。

對于制藥領(lǐng)域的支原體檢查，歐洲藥典規定，以PCR為代表的核酸擴增技術(shù)如果要替代培養法，其檢測限需至少達到10CFU/ml。

德國Minerva Biolabs公司（簡(jiǎn)稱(chēng)MB）提供有歐洲藥典規定的9種支原體的10CFU靈敏度標準品，經(jīng)過(guò)精準標定，可用于PCR/qPCR的靈敏度驗證。

菌株均來(lái)自英國菌種保藏中心（NCTC），具有ATCC編號。

為避免給實(shí)驗室帶來(lái)污染，支原體均經(jīng)過(guò)滅活，并且為凍干粉形式，4℃保存，性能穩定。

每種支原體靈敏度標準品提供有CFU與GC（基因組拷貝數）的換算數值。