1+1＞2，CRISPR和免疫細胞聯(lián)合抑制癌細胞，德國MB支原體檢測助力科研

CRISPR-Cas9是一種常用的基因編輯技術(shù)，可以用來(lái)改造細胞。被改造的細胞有希望應用于各類(lèi)疾病的治療。細胞治療項目需要通過(guò)支原體檢測，才有可能被用于臨床。德國MB支原體qPCR檢測試劑盒，通過(guò)歐洲藥典和日本藥典的方法學(xué)驗證。

表達轉基因T細胞受體(tcr)或嵌合抗原受體(CARs)的T細胞，已成為一些惡性腫瘤的有效治療選擇。然而，T細胞功能可因慢性刺激而失效。慢性刺激的T細胞可以分化為功能失調狀態(tài)，其特征是抑制受體(如PD-1, LAG-3和TIM-3)的表達，增殖和細胞因子的產(chǎn)生減少，轉錄組和染色質(zhì)景觀(guān)改變。以衰竭為特征的T細胞功能障礙已被確定為治療反應不良的主要原因因此，在包括慢性刺激和強直信號在內的環(huán)境中，改善治療性T細胞的適應性是改善臨床反應的一個(gè)有希望的策略。

基因組工程的進(jìn)步提供了許多增加T細胞適應性的方法。

一種方法是在內源性TCR α常數(TRAC)鏈13的啟動(dòng)子調控下，通過(guò)靶向CAR整合或篩選共刺激結構域來(lái)確定有利的CAR設計來(lái)調節CAR調節/信號轉導。

第二種方法使用CRISPR-Cas9去除限制持久T細胞功能的基因。從pd -1開(kāi)始，crispr - cas9介導的抑制受體敲除(KO)已經(jīng)在臨床試驗中進(jìn)行了嘗試功能喪失篩選繼續指出了增加T細胞適應性的擾動(dòng)，如Regnase-1和/或Roquin，Ptpn2，SOCS1，或rasa2。

作為第三種方法，使用CRISPR激活(CRISPRa)25或開(kāi)放閱讀框(orf)的慢病毒文庫進(jìn)行的功能獲得篩選，已經(jīng)揭示了其可能性，如淋巴蛋白β受體(LTBR)的過(guò)表達。然而，這些功能獲得篩選方法并沒(méi)有在原代人T細胞中大規模地與抗原特異性tcr或car結合，而且CRISPRa篩選不能測試合成的基因產(chǎn)物。

一種很有前景的方法是通過(guò)直接調節轉錄調節因子或通過(guò)合成表面受體(SRs)改變細胞對外部信號的反應來(lái)設計TCR-/CAR-T細胞的狀態(tài)。例如，過(guò)表達AP-1/ATF轉錄因子(tf) c-Jun或BATF可以改善CAR-T細胞功能。許多研究小組設計了編碼“開(kāi)關(guān)"受體的合成基因，通過(guò)將抑制受體的結構域(如PD-1)融合到激活結構域(如CD28)，將抑制信號轉化為激活信號。包括CD200R/CD28和TIM-3/CD28在內的一系列合成受體已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，但需要系統的分析來(lái)了解控制哪些結構域配對有效的規則。更廣泛地說(shuō)，需要一種模塊化篩選方法來(lái)發(fā)現可以與特定tcr /CARs結合的tf或sr的組合，以提高功能性能。

靶向crispr介導的敲入蛋白(KI)篩選不僅允許在特定位點(diǎn)上測試構建體，而且還克服了匯集的lenti /逆轉錄病毒篩選方法的幾個(gè)局限性:病毒重組、半隨機整合和可變整合數。研究人員之前開(kāi)發(fā)了一個(gè)非病毒池KI (PoKI)平臺，并篩選了一個(gè)包含36個(gè)成員的庫，結合ny - eso -1特異性tcr。然而，由于模板切換導致的大量條形碼/構建錯配阻礙了該方法的擴展，這限制了庫的大小和適應性。

近日，科研人員開(kāi)發(fā)了模塊化池KI篩選(ModPoKI)，這是一個(gè)使用條形碼多順子適配器模塊化構建DNA KI庫的適應性平臺。相關(guān)研究發(fā)表在《Cell》上，文章標題為：“Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies"。

研究人員構建了兩個(gè)ModPoKI文庫，包含100個(gè)轉錄因子(tf)和129個(gè)天然和合成表面受體(SRs)。在不同條件下對人類(lèi)TCR-和CAR-T細胞進(jìn)行了30多次ModPoKI篩選，發(fā)現了一種轉錄因子AP4 (TFAP4)結構，該結構在體外和體內增強了慢性刺激CAR-T細胞的適應性和抗癌功能。ModPoKI的模塊化使我們能夠生成一個(gè)約10,000個(gè)成員的TF組合庫。BATF-TFAP4多順?lè )措娮咏Y構的非病毒KI增強了適應度。過(guò)表達的BATF和TFAP4共同占據并調控關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，重編程T細胞功能。ModPoKI有助于發(fā)現復雜的基因結構來(lái)編程細胞功能?？偟膩?lái)說(shuō)，這些研究強調了大規模ModPoKI篩選是一種強大的方法，可以加速細胞狀態(tài)的編程，增強持久性和治療功能。