支原體PCR檢測——德國MB Venor Gem Classic使用指南

支原體污染是細胞培養實(shí)驗中，較為常見(jiàn)又十分棘手的問(wèn)題。日常實(shí)驗中，需要對細胞培養環(huán)境定期清潔；對細胞培養上清液、培養基和生物制藥生產(chǎn)環(huán)節進(jìn)行的支原體污染監測。尋找一種快速、可靠和節省時(shí)間的常規監測手段對于提高實(shí)驗效率、維持實(shí)驗結果的穩定十分重要。

德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor®GeM經(jīng)典試劑盒，為檢測細胞培養物和其他生物基質(zhì)中支原體而設計?；趥鹘yPCR方法，可實(shí)現快速、穩健、高靈敏度的支原體污染檢測。

產(chǎn)品名稱(chēng)：支原體常規PCR檢測試劑盒

英文：Venor® Gem Classic    

品牌：Minerva-Biolabs®    

貨號：11-1025

規格：25次/盒  

產(chǎn)品特點(diǎn)及原理

該試劑盒針對支原體基因組中的一個(gè)高度保守區域：16s rRNA編碼區，以檢測歐洲藥典第2.6.7章(EP 2.6.7)、日本藥典第G3章(JP G3)和更多物種中包含的所有物種，根據支原體種類(lèi)的不同，擴增子的大小在265-278 bp之間。

試劑盒設計滿(mǎn)足EP 2.6.7和JP G3不同樣品材料(如細胞培養上清、細胞培養基、Tris緩沖液)的檢測標準。該檢測方法適用于通常用于研究的細胞培養上清、“細胞培養富集"方法或DNA提取后的支原體直接檢測。該試劑盒符合EP 2.6.7和JP G3的要求。

整個(gè)測試僅需要3小時(shí)左右的時(shí)間，并且與基于發(fā)光的酶測定、熒光染色或培養方法相比，不需要活的支原體細胞。

使用方法詳解

一、普通細胞培養物的預處理

當細胞培養達到80% - 90%的融合度時(shí)，收集樣品。細胞培養上清液非常適合支原體試驗，不需要額外的樣品制備。

細胞培養中支原體的平均滴度為10^6-10^8顆粒/ ml。在此范圍內，上清液中存在足夠數量的支原體DNA，可以成功應用PCR檢測。

1. 從細胞培養液中取100µl上清至1.5 ml反應管中。把蓋子蓋緊。

2. 將樣品上清液在95℃下孵育10分鐘(至少5分鐘)。

3.以最大轉速離心樣品。15秒的速度使細胞碎片成顆粒。

4. 直接使用2µl進(jìn)行PCR，或在+2至+8°C或≤- 18°C下長(cháng)期保存樣品6天。

二、.生物藥或需遵循藥典的預處理

1、樣品富集

（可根據實(shí)際情況選做）

對于樣品體積> 200µl，建議采用樣品富集的方法以獲得最佳靈敏度。請注意，樣品濃度方案只適用于完整的支原體細胞。

因此，在樣品濃縮之前，必須避免任何破壞細胞的程序(例如通過(guò)熱失活)?？芍苯犹幚?00µl體積的樣品，無(wú)需樣品

濃度的一步。

① 將最多1ml樣品上清液轉移到1.5 ml反應管中。

② ≥10,000 x g離心15分鐘(或≥13,000 x g離心6分鐘)，使支原體顆粒成球。

③丟棄上清，用200µl Tris緩沖液(10 mM Tris- hcl, pH 8.4)重懸小球。

④使樣品短暫旋轉，然后立即進(jìn)行樣品穩定或DNA提取。

2、樣品預穩定

（可根據實(shí)驗需求選做）

細胞培養樣品可能含有高濃度的DNA酶，即使在低溫下也會(huì )降解支原體DNA。因此，我們建議采取以下步驟來(lái)穩定樣品。如果在樣品采集后立即進(jìn)行DNA提取，則可以省略此步驟。

①從細胞培養液中取500µl上清轉移到1.5 ml反應管中。把蓋子蓋緊。

②樣品在95°C下孵育10分鐘。

③以最大轉速離心樣品。速度短暫(15秒)，以顆粒細胞碎片。

④用樣本提取DNA。在+2至+8°C或≤- 18°C的條件下長(cháng)期保存樣品，最長(cháng)可保存6天。

3.DNA提取

大量證據表明，需要提取DNA才能達到比較高的靈敏度。許多DNA提取方法建立了各種各樣的樣品材料。然而，DNA提取方法必須與支原體和樣品特異性相適應。對于EP和jp兼容的測試，DNA提取方法必須與PCR試劑盒結合進(jìn)行測試。我們推薦Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat：56 - 1010 / -1050/-1200)。該DNA提取試劑盒為此目的進(jìn)行了廣泛的測試。

一、準備PCR試劑

二、配制反應體系

普通細胞培養物

14.5 µl 水

2.5 µl 10×緩沖液

2.5 µl 引物/dNTP溶液

2.5 µl 內控

1.0 µl Taq酶 (1 unit)

每個(gè)PCR管移液23µl，丟棄剩余材料，使反應混合物渦旋5秒。

生物藥或需遵循藥典的樣本

體系包含：

6.5 µl 水

2.5 µl 10×緩沖液

2.5 µl 引物/dNTP溶液

2.5 µl 內控 

1.0 µl Taq酶 (1 unit)

每個(gè)PCR管移液23µl，丟棄剩余材料，使反應混合物渦旋5秒。

三、加樣

在配制好的反應體系中，分別加入陰性(無(wú)模板對照，NTC)對照、陽(yáng)性對照、樣品.

普通細胞培養物

• 陰性對照:加入2µl PCR級水(白色帽)。

• 樣品:加入細胞培養上清或DNA提取液2µl。

• 陽(yáng)性對照:加入2µl陽(yáng)性對照DNA(綠色帽)。

• 關(guān)閉并渦旋所有PCR管，加載PCR儀并啟動(dòng)程序。

  
  

生物藥或需遵循藥典的樣本

• 陰性對照:加入10µl PCR級水(白色帽)。

• 樣品:加入DNA提取液10µl。

• 陽(yáng)性對照:加入2µl陽(yáng)性對照DNA(綠色帽)。

• 關(guān)閉并渦旋所有PCR管，加載PCR儀并啟動(dòng)程序。

四、開(kāi)始擴增

將PCR管放入PCR儀并蓋緊蓋子，按照下圖中的程序設置PCR儀，并開(kāi)始程序。

五、瓊脂糖凝膠電泳與結果分析

注意事項

?由于細胞碎片對PCR反應的負面影響，不能直接使用細胞團進(jìn)行檢測。細胞顆粒、胎牛血清(FCS> 5%)、疫苗、冷凍儲存和石蠟包埋樣品，在PCR前需要提取DNA。Venor®GeM經(jīng)典試劑盒使用Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat.56-1010/-1050/-1200)進(jìn)行DNA提取。提取的DNA可在+2至+8°C下保存6天。長(cháng)期儲存必須在≤- 18°C。

?培養基中的青霉素或鏈霉素不抑制支原體，也不影響試驗的敏感性。

?不建議將不同批號的試劑混合使用。試劑盒中的試劑如果超過(guò)保質(zhì)期，也不建議使用。

?嚴格遵守實(shí)驗操作規范。任何偏差都可能影響測試方法和結果。

?如果提取DNA，使用新鮮的細胞培養基或洗脫緩沖液作為陰性對照。

?在陰性對照和測試反應后準備陽(yáng)性對照，避免交叉污染。PCR抑制可能是由樣品基質(zhì)引起的，或者在提取DNA的情況下，由洗脫緩沖液引起的。因此，我們推薦Venor®GeM樣品制備試劑盒。任何其他DNA提取試劑盒都需要驗證。