如何提高細胞實(shí)驗成功率？污染控制千萬(wàn)要做好！

細胞污染是生物實(shí)驗室中常見(jiàn)的問(wèn)題之一，輕則引起細胞狀態(tài)改變，降低實(shí)驗結果的可重復性，重則會(huì )直接導致細胞的死亡，影響實(shí)驗進(jìn)度。因此，預防細胞污染，是細胞培養成功的關(guān)鍵點(diǎn)之一

如何控制細胞實(shí)驗過(guò)程中的污染？本期內容，為大家提供一些關(guān)鍵的方法和策略。

一、生物污染

細胞的體外生存環(huán)境，可以說(shuō)是“危機四伏"?？諝庵衅≈?zhù)各種肉眼難以捕捉的微生物，稍有不慎，細胞就會(huì )被感染。不僅如此，如果實(shí)驗操作不夠規范，還有可能出現細胞交叉污染的情況。

1、細菌污染

細菌是一種原核細胞微生物，一般為微米級別。細胞培養過(guò)程中常見(jiàn)的污染菌為大腸桿菌、葡萄球菌、假單胞菌等。

細胞發(fā)生細菌污染后，有哪些癥狀？與其他污染相比，細菌污染在細胞培養過(guò)程中“發(fā)病"更為迅速，較容易被發(fā)現。當細胞出現如下癥狀時(shí)，基本可以斷定，細胞發(fā)生了細菌污染：

①細胞培養基在短時(shí)間內迅速渾濁；

②靜置的培養液時(shí)不渾濁，但稍加震蕩，就有許多渾濁物漂起；

③顯微鏡下可見(jiàn)培養液中有大量圓球狀顆粒物漂??；

④細胞停止生長(cháng)、出現大量死亡；

如果細胞不幸遭遇到了細菌污染的侵襲，該如何應對呢？我們建議直接將細胞丟棄，并對培養環(huán)境消毒。國際上大多數實(shí)驗室會(huì )使用Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾），對超凈臺、培養箱等環(huán)境進(jìn)行消殺。

2、支原體污染

支原體（mycoplasma）是一類(lèi)沒(méi)有細胞壁、高度多形性、部分可用人工培養基培養增殖的原核細胞型微生物，大小為0.3微米左右。在細胞培養過(guò)程中，顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細胞競爭營(yíng)養，影響細胞生長(cháng)，最終導致實(shí)驗出現偏差，當細胞出現如下癥狀時(shí)，基本可以斷定，細胞發(fā)生了支原體污染：

①生長(cháng)速率緩慢、活力下降、易脫壁；

②細胞形態(tài)改變；

③細胞易聚團；

④在顯微鏡下，可見(jiàn)培養液中產(chǎn)生大量碎片（培養基不渾濁）；

⑤在培養過(guò)程中，培養液很快變黃（意味著(zhù)培養液中有看不見(jiàn)的大量微生物繁殖，營(yíng)養被消耗）；

由于支原體體型微小，在細胞培養過(guò)程中，普通光學(xué)顯微鏡很難觀(guān)察到，只有在電鏡下才能拍到支原體的照片。細胞培養過(guò)程中的支原體污染，會(huì )大量消耗培養液中的營(yíng)養。98%會(huì )附著(zhù)在細胞表面，導致細胞生長(cháng)狀態(tài)發(fā)生異常，甚至引起死亡，最終導致實(shí)驗數據發(fā)生異常。

如果細胞被支原體污染，該如何處理？對與支原體污染的細胞，優(yōu)先考慮丟掉細胞，重新培養。

①對于非常珍貴的細胞株（不可再得的）國際上使用Mynox® Gold，做4周左右的支原體祛除持續培養實(shí)驗。

②對于非常珍貴的細胞株或生物樣品（無(wú)法長(cháng)期培養的），可使用Mynox®，對細胞做3小時(shí)左右的祛除支原體處理，處理完畢，沖洗細胞，將樣品放入潔凈的培養液中，重新培養或保存即可。

③對于已經(jīng)進(jìn)行到中途的細胞實(shí)驗，如果將培養的大量細胞丟棄，會(huì )造成高昂的實(shí)驗成本損失。對于這樣的情況，補救辦法如下：在培養液中加入10%的Zell Shield®（一種新型復合抗生素）。按照廠(chǎng)家建議的方法，配合處理細胞，培養4代以上，基本可祛除支原體污染。

④一些做原代培養的實(shí)驗室，為了預防取原代細胞過(guò)程中可能會(huì )發(fā)生支原體污染，實(shí)驗人員也可以在培養液中加入10%的Zell Shield®（一種新型復合抗生素），培養4代以上，即可撤掉Zell Shield®，此過(guò)程可有效預防支原體污染的發(fā)生。

3、真菌污染

真菌是一類(lèi)具真核和細胞壁的異養生物。真菌可以通過(guò)孢子延續種群，典型的營(yíng)養體為絲狀分支結構?？晌廴炯毎囵B基的真菌種類(lèi)繁多，最常見(jiàn)的有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。當細胞出現上述癥狀時(shí)，基本可以斷定，細胞發(fā)生了真菌污染：

①在細胞培養液中會(huì )形成淡黃色或白色的漂浮物，肉眼可見(jiàn)，但培養液在短期內不變混濁；

②顯微鏡下可以看見(jiàn)細胞之間或是培養液中，有縱橫交錯穿行的絲狀，樹(shù)枝狀或管狀菌絲；

③多數菌絲在高倍鏡下可以觀(guān)察到鏈狀排列的菌株，而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散落在細胞上及細胞周邊生長(cháng)。

細胞發(fā)生真菌污染時(shí)，需要將細胞丟棄，并對培養環(huán)境消毒，國際上大多數實(shí)驗室會(huì )使用Mycoplasma-off™噴霧劑，對超凈臺、培養箱等環(huán)境進(jìn)行消殺。

二、加強細胞間管理，是解決細胞污染真正有效的方法

匯總了各大實(shí)驗室的工作流程：

1、在正式進(jìn)入細胞間前，需要在緩沖隔離間佩戴好細胞實(shí)驗室專(zhuān)用的防護用具：口罩、防護服、鞋套等，開(kāi)始實(shí)驗前，佩戴好手套。

2、定期使用Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾），對工作區域消殺（建議半個(gè)月一次，但需根據細胞間實(shí)際使用頻率決定）。

3、每次實(shí)驗開(kāi)始前，和實(shí)驗結束后，用紫外線(xiàn)對細胞間進(jìn)行照射消毒，實(shí)驗操作前用酒精或Mycoplasma-off™噴霧劑對操作人員的手套進(jìn)行噴涂消毒。

4、在水浴鍋或培養箱水槽的水中，加入0.5%的Water Shield™，可確保一個(gè)月內水源不會(huì )變成支原體、真菌或細菌的污染源。

5、如果細胞間內，發(fā)生多株細胞的聯(lián)合的支原體污染情況，建議在做上述1-4的操作的同時(shí)，將液氮罐，也用Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾）進(jìn)行消殺，并更換潔凈的液氮，（液氮罐中凍存的細胞發(fā)生支原體污染，也會(huì )在液氮中引起污染的的傳播）。

上述內容只分析了生物因素污染，在實(shí)際培養過(guò)程中，可能還會(huì )發(fā)生物理或化學(xué)污染，請自行排除，本文不再贅述。

三、使用高品質(zhì)的實(shí)驗試劑，降低細胞污染風(fēng)險

胎牛血清是細胞培養中常用的培養基補充物，以維持細胞的生長(cháng)和健康。選擇高品質(zhì)的胎牛血清，可以盡可能降低細胞污染的風(fēng)險。

高品質(zhì)的胎牛血清，血源清晰、通過(guò)嚴格的質(zhì)量檢測，并在檢測報告上，表明批次、內毒素含量、無(wú)菌檢測和病原檢測情況、蛋白含量等指標，清晰且明確。以科研人常用的Ausbian進(jìn)口特級胎牛血清為例，澳洲血源，內毒素含量≤3EU/ml，無(wú)菌檢測和病原檢測結果均為“未檢出"病毒和細菌，蛋白含量也有注明，品質(zhì)如何，一目了然！