簡(jiǎn)析我國藥典中對新生牛血清的要求

我國藥典中規定，新生牛血清是從出生14小時(shí)內未進(jìn)食的新生牛采血分離血清，經(jīng)除菌過(guò)濾后制成。牛血清生產(chǎn)過(guò)程中不得任意添加其他物質(zhì)成分。新生牛血清應進(jìn)行以下檢查，符合規定后方可使用。

如釆用經(jīng)過(guò)驗證的病毒滅活工藝處理的牛血清，大腸埃希菌噬菌體及病毒檢測必須在滅活前取樣進(jìn)行。

pH值：應為7.00~8.50。

蛋白質(zhì)含量：采用雙縮脲法（通則0731第三法）或其他適宜方法測定，應為35~50g/L。

血紅蛋白：用分光光度法或其他適宜的方法測定，應不高于200mg/L。

滲透壓摩爾濃度：應為250~330mOsmol/kg（通則0632）。

細菌內毒素檢查：應不高于10EU/ml（通則1143凝膠限度試驗）。

支持細胞增殖檢查：采用傳代細胞（HFL1、Mv1 Lu、Vero和CHO）中的任意1種細胞及Sp2/0-Ag14細胞進(jìn)行。細胞復蘇后，用待測樣品配制的培養液至少連續傳3代后使用，取對數生長(cháng)期的細胞用于試驗。

（1）細胞生長(cháng)曲線(xiàn)的測定  取供試品按10%濃度配制細胞培養液，Sp2/0-Ag14按每1ml含1×10^4的細胞濃度，其他貼壁細胞按2×104的細胞濃度接種細胞，每天計數活細胞，連續觀(guān)察1周，并繪制生長(cháng)曲線(xiàn)。

（2）細胞倍增時(shí)間的測定  按生長(cháng)曲線(xiàn)計算細胞的倍增時(shí)間。取細胞峰值前一天的細胞計數（Y）、接種細胞數（X）及生長(cháng)時(shí)間（T）計算。

Sp2/0-Ag14細胞應不超過(guò)20小時(shí)；HFL1細胞應不超過(guò)22小時(shí)；Mv1 Lu細胞應不超過(guò)24小時(shí)；Vero細胞應不超過(guò)18小時(shí)；CHO細胞應不超過(guò)22小時(shí)。

（3）克隆率的測定  將細胞稀釋至每1ml含10個(gè)活細胞的濃度，按每孔1個(gè)細胞接種于96孔細胞培養板，每板至少接種60孔，于37℃、5%二氧化碳培養，定期觀(guān)察細胞克隆生長(cháng)情況，培養1周后計數每孔中的細胞克隆數，并計算克隆率，應不低于70%。

無(wú)菌檢查：依法則檢查（通則1101），應符合規定。

支原體檢查：依法則檢查（通則3301），應符合規定。

大腸埃希菌噬菌體：采用噬斑法和增殖法檢測。不得有噬菌體污染。

病毒檢查：

（1）樣品制備　取約250ml的新生牛血清供試品用于檢測，將其配制成含15%供試品的培養液，用于檢測全過(guò)程的細胞換液及傳代，以檢測合格的血清作為陰性對照血清。

（2）指示細胞制備　至少采用猴源（如Vero細胞）、2種牛源細胞（BT和MDBK細胞或無(wú)病毒污染的原代牛腎細胞）以及人二倍體細胞作為指示細胞，細胞復蘇后至少傳代1次后使用，根據所需量制備足夠量的細胞。

（3）用含有供試品的培養液將4種指示細胞分別接種于75cm2細胞培養瓶中，接種量應使細胞在培養7天后可達到至少80%～90%匯合。同時(shí)制備陰性對照血清培養瓶。將培養瓶置37℃、5%CO2培養箱中培養至少7天?？稍诘?span>5天時(shí)換液一次。

（4）第7天進(jìn)行第1次盲傳，將接種供試品及陰性對照的每種指示細胞培養瓶分別傳出至少2個(gè)75cm2培養瓶，繼續培養至第14天，在第12天時(shí)可換液一次。

（5）在第13天時(shí)（或第2次傳代前1天）或陰性對照瓶細胞達到至少70%匯合時(shí)，制備陽(yáng)性對照用細胞。即取1個(gè)陰性對照細胞瓶分別傳至6孔板或其他適宜的細胞板中用于細胞病變觀(guān)察（CPE）、血吸附檢查（HAd）及熒光抗體檢測（IF），次日接種陽(yáng)性對照病毒。

（6）第14天時(shí)進(jìn)行第2次盲傳。將第1次傳代后的細胞培養物分別傳至6孔板或其他適宜的細胞板中，進(jìn)行細胞病變觀(guān)察及HAd檢查時(shí)，接種于每種指示細胞上的待測樣本至少接種3孔；進(jìn)行熒光抗體檢測時(shí)，接種于每種指示細胞上的待測樣本進(jìn)行每種病毒檢測時(shí)至少接種2孔。繼續培養至少至第21天，剩余細胞樣本－60℃或以下保存備用。

（7）在第14天接種陽(yáng)性對照病毒：?。?span>5）制備的指示細胞接種適量陽(yáng)性對照病毒，置36℃±1℃、5%CO2培養箱吸附2小時(shí)，吸棄上清液，加入適量細胞維持液，置36℃±1℃、5%CO2培養箱培養7天，對于BT細胞，BVDV可作為病變陽(yáng)性對照，BPI3可作為HAd陽(yáng)性對照，牛副流感病毒3型（PI3）、牛腺病毒（BAV-3）、牛細小病毒（BPV）以及牛腹瀉病毒（BVDV）可作為IF檢測陽(yáng)性對照；對于MDBK細胞，呼腸孤病毒3型（REO3）和PI3可分別作為細胞病變及HAd檢查陽(yáng)性對照，PI3、BAV-3、BVDV、REO-3為IF檢測陽(yáng)性對照；對于Vero細胞，Pl3可作為細胞病變及HAd檢查陽(yáng)性對照，PI3及REO-3作為IF檢測陽(yáng)性對照?？刹辉O立狂犬病病毒（Rabies）陽(yáng)性對照。所有IF檢測陽(yáng)性對照病毒應接種100～300CCID50。

（8）接種陰性對照及供試品的細胞培養物在接種后每日觀(guān)察細胞病變情況，在接種后至少21天或末次傳代后至少7天時(shí)分別進(jìn)行病變觀(guān)察、HAd檢查及IF檢測，陽(yáng)性對照培養物在接種后第7天或10%細胞出現CPE時(shí)可進(jìn)行IF檢測。

進(jìn)行血吸附檢查時(shí)，用雞與豚鼠血紅細胞在2～8℃及20～25℃進(jìn)行檢測。

進(jìn)行熒光抗體檢測時(shí)，將細胞固定后采用直接或間接免疫熒光抗體檢查法，至少應對BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及 Rabies進(jìn)行檢查，結果均應為陰性。

（9）結果判定　陰性對照應無(wú)細胞病變，血吸附檢查應為陰性，熒光抗體檢測應為陰性；陽(yáng)性對照應有明顯的細胞病變，血吸附檢查應為陽(yáng)性，熒光抗體檢測應為陽(yáng)性，判為試驗成立。供試品如無(wú)細胞病變，血吸附檢查為陰性，且熒光抗體檢測為陰性，判定為符合要求。待測樣本如出現細胞病變，或血吸附檢查為陽(yáng)性，或任何一種熒光抗體為陽(yáng)性，則判定為不符合要求。

經(jīng)病毒滅活處理的牛血清，滅活前取樣檢測后若任何一項檢測顯示為陽(yáng)性，不建議用于生產(chǎn)。除非可鑒別出污染的病毒，且病毒滅活工藝驗證研究顯示其污染量可被有效滅活時(shí)方可使用，如果滅活前BVDV病毒檢測為陽(yáng)性，滅活后還應取樣采用敏感的方法檢測BVDV，結果陰性為符合要求。

未經(jīng)病毒滅活處理的牛血清若任何一項檢測顯示為陽(yáng)性，則不得用于生產(chǎn)。

不能用感染試驗檢測的牛源性病毒可采用核酸檢測法，但應采用較大量的樣品提取核酸（如25～50ml的血清樣本），并計算合并血清的檢測限。