用qPCR方法檢測支原體的關(guān)鍵點(diǎn)——樣品制備

qPCR（定量聚合酶鏈反應）方法在檢測細胞樣品中的支原體時(shí)具有多個(gè)優(yōu)勢：

高靈敏度和特異性： qPCR能夠檢測極低濃度的核酸，使其對支原體的早期檢測更為敏感。引物的設計可以確保對目標支原體的高度特異性，減少誤報和假陽(yáng)性的可能性。

快速性： qPCR是一種高效的方法，通常在幾小時(shí)內就能完成。這使得可以迅速獲取支原體存在的定量信息，為及時(shí)采取措施提供了可能。

定量能力： 與傳統PCR不同，qPCR可以提供關(guān)于支原體數量的定量信息，而不僅僅是檢測是否存在。這對于評估感染的程度和追蹤治療效果非常重要。

自動(dòng)化和高通量： qPCR可以輕松集成到自動(dòng)化平臺中，實(shí)現高通量的樣品處理。這使得可以同時(shí)處理大量樣品，提高檢測的效率。

實(shí)時(shí)監測： qPCR是實(shí)時(shí)監測反應的技術(shù)，能夠在擴增過(guò)程中實(shí)時(shí)測量核酸的累積量。這有助于確定PCR反應何時(shí)進(jìn)入指數增長(cháng)階段，提高結果的準確性。

低檢測限： qPCR的靈敏度使其能夠檢測非常低濃度的核酸，即使在樣品中支原體數量很少的情況下也能夠可靠地檢測到。

綜合來(lái)看，qPCR在檢測細胞樣品中的支原體方面具有高度敏感、定量準確、快速高效等優(yōu)勢，使其成為支原體研究和臨床檢測中的重要工具。

在進(jìn)行qPCR檢測前，需要對樣品進(jìn)行處理。在處理過(guò)程中，以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)需要注意。

一般來(lái)說(shuō)，樣品和標準品不應長(cháng)時(shí)間放置。這可能會(huì )損害標準品的恢復。

使用的反應容器也會(huì )對樣品DNA提取造成影響，如果沒(méi)有使用低結合核酸反應管，DNA最終容易粘在表面。

在提取DNA之前，將200µl樣品基質(zhì)在70℃下失活10分鐘是很重要的。培養基及其所含的FBS對PCR有抑制作用，無(wú)法檢測到標準品。

對于10cfu標準品，通過(guò)DNA提取對樣品進(jìn)行純化，對于NAT(核酸擴增技術(shù))即傳統PCR或qPCR的后續擴增具有重要意義。

體積不能偏離標準推薦量。如果改變了濃度因子，則有可能樣品基質(zhì)中不包含任何標準品。

如果出現以上幾種可能性，則標準品或樣品沒(méi)有被檢測的效果就會(huì )被放大。