科學(xué)的『支原體標準品』使用方法，讓檢測結果更靈敏

《歐洲藥典》第2.6.7章（EP 2.6.7）以及《日本藥典》第G3章（JP G3），詳細描述了如qPCR等方法、基于核酸擴增技術(shù)（NAT）的支原體檢測。這些藥典中指出，如果需要用NAT法替代傳統方法，要求顯示每毫升樣品體積(CFU/ml)中10個(gè)菌落形成單位的檢測，即靈敏度達到10CFU/ml。這種靈敏度驗證是方法驗證的一條必經(jīng)之路。

然而，由于一些細胞培養實(shí)驗室、研究機構、生產(chǎn)線(xiàn)不配備符合支原體培養條件的標準化微生物實(shí)驗室，很難實(shí)現在實(shí)驗室中培養或處理活的、用于靈敏度測試的支原體菌落。10CFU靈敏度標準品（不可逆滅活的支原體）便應運而生。為了保障滅活菌株的使用效果，德國Minerva Biolabs潛心研制，將先進(jìn)的凍干粉技術(shù)用于支原體檢測標準品的生產(chǎn)過(guò)程中，盡可能保障在運輸過(guò)程中不破壞其生物活性，能夠幫助科研人員實(shí)現更高靈敏度的檢測驗證。

產(chǎn)品雖好，但也需要配合科學(xué)的使用方法才能事半功倍。本期內容，我們就來(lái)一起探討，支原體檢測標準品的科學(xué)使用方法。

一、標準品的溫度平衡

標準品在不同溫度下，可能會(huì )表現出不同的特性，忽略溫度平衡可能會(huì )導致實(shí)驗結果的不穩定性。

因此，在復溶前需對標準品進(jìn)行溫度平衡處理，以降低因溫度突變引起的損壞或變性的可能性，使標準品溫度逐漸接近溶解時(shí)的溫度，減少溫度變化造成的不良影響，避免基質(zhì)溫度過(guò)低導致凍干粉溶解困難，保證標準品在復溶過(guò)程的穩定性和活性，提高實(shí)驗靈敏度。

具體做法是，在復溶前，需要將標準品從2-8℃環(huán)境中轉移至室溫環(huán)境下，對其進(jìn)行溫度平衡，待所有成分與室溫一致時(shí)，才可進(jìn)行下一步操作。

溫度平衡好后，將標準品放入低速離心機內，短暫離心，通過(guò)旋轉，將附著(zhù)在管壁的凍干粉末甩至瓶底，保障復溶后物質(zhì)濃度穩定。

小心打開(kāi)標準品離心管，沿管壁向每個(gè)離心管中，加入經(jīng)過(guò)室溫平衡的待檢樣品的同款基質(zhì)1ml，室溫孵育5分鐘。不建議用移液器反復吹打，容易造成試劑的浪費。孵育好后，可以漩渦10秒，然后再低速離心機內旋轉5秒，將管壁的液體甩下去。

二、支原體標準品DNA提取與擴增

滅活支原體含有一部分膽固醇和脂質(zhì)，對核酸擴增實(shí)驗會(huì )造成不同程度的影響。因此，在檢測前，需要對支原體標準品進(jìn)行DNA提取，以純化標準品中的DNA。并去除可能存在的 PCR 抑制物質(zhì)，從而提高PCR反應的靈敏度和特異性。此外，經(jīng)過(guò)提取的支原體DNA更容易被PCR擴增，因為純化后的DNA更容易與引物結合，并且不易受到來(lái)自樣品基質(zhì)的干擾。推薦使用配套的Venor®GeM Sample Preparation Kit支原體提取試劑盒（貨號：56-1010）。

根據提取試劑盒的要求，取適量標準品溶液進(jìn)行DNA提取，隨后再進(jìn)行正式的qPCR檢測實(shí)驗。

三、支原體標準品DNA分裝與儲存

很多實(shí)驗人員習慣將用不完的標準品試劑，在復溶后進(jìn)行冷藏或冷凍儲存，其實(shí)這樣的操作會(huì )在很大程度上，降低標準品的生物活性，影響檢測的靈敏度，主要影響因素有以下幾點(diǎn)：

1、降低標準品的生物活性：反復凍融會(huì )導致支原體標準品中核酸等分子結構發(fā)生變化或損壞，降低了標準品的活性、影響其穩定性。這些變化可能會(huì )在標準品的后續使用過(guò)程中，導致實(shí)驗結果出現較大波動(dòng)，影響實(shí)驗結果的準確性。

2、污染風(fēng)險增加：反復凍融會(huì )增加標準品接觸外界環(huán)境的機會(huì )，提高了諸如細菌、真菌等微生物污染，或者其他化學(xué)物質(zhì)的潛在的污染風(fēng)險。

因此，為了確保支原體標準品的活性、穩定性和準確性，我們建議，盡量在復溶后將溶液一次性全部用完，以避免反復凍融帶來(lái)的潛在負面影響。

另外需要注意的是，在任何情況下，都不建議將使用前、還未復溶的標準品進(jìn)行冷凍保存。

相關(guān)人員的研究顯示，在2-8℃環(huán)境中，德國MB公司的凍干粉狀態(tài)穩定，在有效期內保存得當的情況下均可放心使用，是一種經(jīng)濟實(shí)惠又穩健的儲存方式。

如果將凍干粉置于-20℃環(huán)境下，可能會(huì )使水分重新進(jìn)入粉末中，導致標準品重新溶解。這個(gè)過(guò)程中，支原體標準品的結構和活性也會(huì )受到影響，從而降低其可靠性和有效性。此外，冷凍過(guò)程中可能會(huì )引起凍融循環(huán)，導致支原體標準品穩定性下降，影響其在實(shí)驗中的使用效果。