PCR入門(mén)指南（二）：詳解PCR反應步驟

PCR（聚合酶鏈式反應）是一種在分子生物學(xué)中廣泛使用的技術(shù)，能夠以很快的速度在體外大量復制特定的DNA片段。對于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，理解PCR的基本原理和反應步驟是掌握這一技術(shù)的關(guān)鍵。本文將詳細介紹PCR反應的主要步驟，幫助讀者快速入門(mén)。

一、PCR反應原理

PCR技術(shù)基于DNA雙鏈復制的原理，在特定的引物、模板DNA、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）和DNA聚合酶的作用下，通過(guò)高溫變性、低溫復性和適溫延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，實(shí)現DNA片段的指數級擴增。

二、PCR反應步驟

模板DNA的制備：PCR反應的第一步是準備目標DNA模板。這可以通過(guò)提取生物樣本中的DNA，或者使用含有目標DNA序列的質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物等作為模板。

引物設計：引物是PCR反應中重要的組成部分，它們決定了PCR擴增的特異性。引物設計需要遵循一定的原則，如長(cháng)度、GC含量、Tm值等，以確保引物與模板DNA的特異性結合。

PCR反應體系設置：將模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶以及反應緩沖液等按照一定比例混合，形成PCR反應體系。在反應體系中，DNA聚合酶是關(guān)鍵的酶類(lèi)，它能夠在引物的引導下，沿模板DNA的3'端至5'端方向合成新的DNA鏈。

PCR反應循環(huán)：PCR反應通過(guò)循環(huán)進(jìn)行，每個(gè)循環(huán)包括三個(gè)步驟：

變性（Denaturation）：在高溫（通常為94-98℃）下，雙鏈DNA模板變性為單鏈DNA，為引物與模板的結合提供條件。

復性（Annealing）：在較低的溫度（通常為50-65℃）下，引物與模板DNA上的互補序列結合，形成引物-模板復合物。

延伸（Extension）：在適中的溫度（通常為72℃）下，DNA聚合酶以dNTPs為原料，沿引物-模板復合物的3'端至5'端方向合成新的DNA鏈。

PCR產(chǎn)物檢測：PCR反應結束后，可以通過(guò)凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數量。凝膠電泳可以直觀(guān)地展示PCR產(chǎn)物的長(cháng)度和數量，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR則可以實(shí)時(shí)監測PCR反應的進(jìn)程，并計算目標DNA的初始濃度。

三、PCR反應注意事項

引物設計要合理，避免引物間的二聚體和非特異性擴增。

PCR反應體系中的各組分濃度要適宜，避免過(guò)高或過(guò)低的濃度影響PCR反應的效果。

PCR反應過(guò)程中要嚴格控制溫度和時(shí)間，確保每個(gè)步驟都能正常進(jìn)行。

避免PCR產(chǎn)物的污染，防止假陽(yáng)性結果的出現。適當適用德國MB公司生產(chǎn)的PCR Clean核酸污染祛除試劑，能供高效清除分子實(shí)驗室中的核酸污染。