CCA顯色培養基在水的標準檢驗中的應用

微生物檢測產(chǎn)品生產(chǎn)商HiMedia Laborotaries公司生產(chǎn)的CCA顯色培養基（貨號：M1991I-500G，英文品名：HiCromeTM Chromogenic Coliform Agar）是一款值得注意的產(chǎn)品，因為它的成分和性能符合新版的ISO9308-1標準（2014版），而該標準論述的正是有關(guān)大腸桿菌和大腸菌群計數的水質(zhì)的標準檢驗。

ISO9308-1.2014采用的是濾膜法聯(lián)合CCA顯色培養基法，用于水中大腸桿菌和大腸菌群的計數。它出結果的時(shí)間更短，只有24小時(shí)（而2000年版ISO9308采用乳糖TTC瓊脂，需48小時(shí)），而且無(wú)須額外的培養基進(jìn)行驗證試驗。

在CCA顯色培養基中，大腸菌群（不含大腸桿菌）表達β-D-半乳糖苷酶，分解顯色底物，從而為粉紅色菌落；大腸桿菌同時(shí)表達β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶，表現為藍紫色菌落；而其他非大腸菌群菌（如綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌）為無(wú)色；糞腸球菌的生長(cháng)則受到抑制。

圖. HiCromeTM CCA顯色培養基培養反應

為什么要同時(shí)檢測大腸菌群和大腸桿菌？對于人類(lèi)來(lái)說(shuō)，水被糞便污染一直是一個(gè)問(wèn)題。大腸桿菌，其實(shí)是人腸道的正常菌群，它隨糞便被排出體外，因而被看作是水是否被糞便污染的指示菌。大腸菌群則較為復雜，因為有的大腸菌群生活在土壤和新鮮的地表水中，并不總是在人的腸道內。大腸菌群并不作為糞便污染的指征，但可以指示出水在凈化、儲存和運輸過(guò)程中存在的問(wèn)題。

ISO9308-1.2014中的操作方法大致如下：先取水樣100ml（或其他體積），在5±3℃運輸和保存。應保證在取樣的24小時(shí)內檢測。再將水樣用濾膜過(guò)濾。過(guò)濾膜應47mm或50mm直徑，0.45μm孔徑，有網(wǎng)格線(xiàn)，并且需保證無(wú)菌。過(guò)濾后細菌就被截留在濾膜上，然后將濾膜貼到CCA顯色培養基上。放置時(shí)應保證下面沒(méi)有氣泡。然后倒轉平板，孵育21±3小時(shí)，36±2℃。之后就可檢查過(guò)濾膜上的菌落并計數。

ISO9308-1.2014指出，顯色后，大腸菌群（粉紅色菌落）應再用氧化酶試紙條進(jìn)行驗證試驗（大腸菌群為氧化酶陰性），因為一些氧化酶陽(yáng)性菌(如氣單胞菌屬)可能帶來(lái)假陽(yáng)性。具體是應至少選擇10個(gè)粉紅菌落，進(jìn)行氧化酶試驗，或向平皿中的濾膜滴加氧化酶試劑2-3滴，陽(yáng)性反應為深藍色（30秒內）。大腸桿菌無(wú)須驗證。如需驗證時(shí)，可進(jìn)行吲哚試驗。大腸桿菌為吲哚試驗陽(yáng)性，而其他大腸菌群為陰性。

值得指出的是，該標準方法選擇性不強，它適合低菌群背景的樣本，因為背景生長(cháng)可能干擾計數。ISO指出，它適合菌落數小于100的水樣，例如：飲用水、自來(lái)水、消毒的池水，而對于地表水和井水，該方法并不適合。

注意：對于大腸桿菌O157，CCA培養基不會(huì )將其識別為大腸桿菌。大腸桿菌O157將被識別為大腸菌群。對于總大腸菌群計數，它應等于氧化酶陰性的粉紅色菌落數+藍紫色菌落數。

據ISO資料顯示：CCA培養基的靈敏度為94%（大腸桿菌）和91%（大腸菌群），特異性為97%（大腸桿菌）和94%（大腸菌群），可見(jiàn)性能還是相當不錯的。而HiMedia公司更提供有化學(xué)限定的CCA顯色培養基，這保證培養基的批間差異極小，批次結果穩定，重復性和準確度進(jìn)一步提升。

我國《GB8538—2016食品安全國家標準·飲用天然礦泉水檢驗方法》提到濾膜法計數大腸菌群。具體是將過(guò)濾水樣的濾膜貼在選擇性鑒別培養基上，經(jīng) 37℃ 培養24h后，大腸菌群細菌在濾膜上長(cháng)出具有特征性的菌落，直接計數典型菌落數，計算出每 100mL 水樣中所含的大腸菌群數。所用培養基為遠藤瓊脂(品紅亞硫酸鈉)培養基。長(cháng)出的菌落還需進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀(guān)察。如為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養液，經(jīng)36℃±1℃培養 24h±2h 后，如產(chǎn)酸產(chǎn)氣則判定為大腸菌群陽(yáng)性。整體耗時(shí)較長(cháng)，步驟較多。

《GBT5750.12-2006 生活飲用水標準檢驗方法——微生物指標》檢測指標包括總大腸菌群和大腸埃希氏菌，都提到酶底物法?？偞竽c菌群也是根據用選擇性培養基上篩查β-半乳糖苷酶陽(yáng)性菌，并提到“可選用市售商品化制品，以此計數來(lái)檢測水中總大腸菌群”。大腸埃希氏菌是根據β-葡萄糖醛酸酶。檢測方法是兩類(lèi)菌分開(kāi)論述的。而CCA顯色培養基可同時(shí)計數并鑒別這兩類(lèi)菌，不可不謂具有更高的效率。

據悉，上海市質(zhì)量技術(shù)監督局已通知，將要更新發(fā)布《DB31/T 1091-2018 生活飲用水水質(zhì)標準》，2018年10月1日開(kāi)始實(shí)施。這雖然是地方性的條例，但畢竟對2006年的國標進(jìn)行了一些改進(jìn)，估計可能會(huì )采納ISO9308-1.2014的方法。