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發(fā)酵微生物在發(fā)酵食品物理化學(xué)和感官特性方面起著(zhù)關(guān)鍵作用。它們也與食品安全相關(guān)，因為需要限制病原微生物和微生物的生長(cháng)。因此，細胞活力的評估對于發(fā)酵食品工業(yè)（特別是乳品部門(mén)）通常是非常重要的。由于發(fā)酵微生物與食品的感官特性密切相關(guān)，因此需要有能力判別細胞的分裂能力，而且需要確定其代謝活動(dòng)和適應性，以改善質(zhì)量控制和終產(chǎn)品。對于益生菌產(chǎn)品，若要對健康產(chǎn)生益處，則還需要確保存在足夠數量的活細胞。
已有一些方法用來(lái)分析參與發(fā)酵過(guò)程的微生物種群的特征。傳統是采用描述性的培養方法，它仍然是確定菌落（即可培養細胞）存在與否及其數量的常用的方法。然而，這些簡(jiǎn)單的方法在微生物種群生理狀態(tài)方面也存在一定的偏差，特別是其中共存幾個(gè)不同生存活力和代謝活性的亞群。于是又誕生了一些分子技術(shù)，能夠描述微生物中間狀態(tài)，以及通過(guò)標志物定量來(lái)判定菌群健康程度及新陳代謝活力的方法，而非僅僅對其生長(cháng)和不生長(cháng)進(jìn)行定量。分子方法包括熒光原位雜交、流式細胞術(shù)、組學(xué)及PCR技術(shù)。PCR技術(shù)已在常規得到引用。
培養法是傳統常用的方法，其局限是缺乏目標菌和伴隨菌之間的鑒別、得出結果的時(shí)間、假陽(yáng)性計數、食品基質(zhì)影響、存在一些活而不可培養的細胞（簡(jiǎn)稱(chēng)VBNC）（即垂死細胞）。VBNC是上世紀80年代才認識到的，因而用活/死細胞染色檢測試劑盒或RT-PCR來(lái)鑒別細胞是能分裂、還是VBNC，或死亡?，F在已經(jīng)認識到，在活細胞和死細胞之間，存在許多中間狀態(tài)。而培養法產(chǎn)生的細胞對應的都是能分裂的細胞。
而人們對培養法仍然注入了許多興趣，培養基得到了改進(jìn)和發(fā)展，例如用于益生菌和非益生菌的選擇性計數，酸奶、奶酪和發(fā)酵劑中雙歧桿菌的選擇性計數等。使用不同的瓊脂平板培養基，可以對許多商品進(jìn)行益生菌存活率的評估。這些商品包括濃縮粉、冷凍材料、膠囊、食品和飲料等?？梢源_定保證活菌低數量的益生菌效期。酸奶和奶酪中益生菌存活的影響因素也得到了研究。但由于培養法也存在一些不足，因此推薦同時(shí)采用分子鑒定的手段進(jìn)行驗證，以保證結果的準確性和可靠性。這對于益生菌計數尤為重要，因為要保證必要的數量。
圖2. HiMedia公司生產(chǎn)的乳桿菌顯色培養基（品名，HiCrome™ Lactobacillus Selective Agar Base，貨號M2065，需添加劑FD345），用于乳桿菌的分離和內部鑒別。嗜酸乳桿菌菌落淡粉色-粉色，鼠李糖乳桿菌菌落為淡綠色，發(fā)酵乳桿菌菌落為黃色，胚牙乳桿菌菌落和乳酸乳球菌乳酸亞種菌落均為淡綠色-綠色（光暈）
圖2. HiMedia公司生產(chǎn)的雙歧桿菌顯色培養基(品名：HiCrome™ Bifidobacterium Agar，貨號M1960)，用于雙歧桿菌和乳桿菌之間的鑒別。嬰兒雙岐桿菌菌落為深藍色至藍綠色，短雙歧桿菌菌落為粉紅色（有光暈），植物乳桿菌菌落為綠色（有霧狀背景），發(fā)酵乳桿菌菌落為粉色無(wú)光暈。
用于致病菌分析的顯色培養基也發(fā)展起來(lái)了，并進(jìn)行了驗證和標準化。的確，李斯特菌、沙門(mén)菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌及其他腸道菌可通過(guò)大量顏色鑒別出來(lái)。顯色培養基使用方便，不需要分子生物學(xué)方面的知識。這在乳品微生物質(zhì)控方面，無(wú)疑非常重要。其發(fā)展對彌補特異方法的不足也有幫助。
鏡檢、流式細胞術(shù)和其他熒光標記方法是否適合食品企業(yè)？將熒光原位雜交（FISH）用于乳品微生物計數已有數篇報道，例如奶酪中的丙酸桿菌檢測和計數。FISH具有高特異性，可觀(guān)察細菌在環(huán)境中的空間分布。FISH的不足是可重復性低，容易有假陽(yáng)性和干擾，因而用于常規分析較為困難。流式細胞術(shù)（FC）可用于單細胞分析，能鑒別各種VBNC和生理狀態(tài)。FC已成為有前景的標記計數，并在食品微生物學(xué)領(lǐng)域已有許多報告。一些熒光染料針對細胞某些組分（如核酸、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)）、細胞內pH值、膜完整性和細胞內離子、活力標志物和膜能量狀態(tài)。也可采用幾種染料同時(shí)進(jìn)行分析。一些學(xué)者用FC研究了食品生產(chǎn)或存儲過(guò)程中遇到的酸、氧化、滲透壓、冷應激對微生物細胞狀態(tài)的影響。批次培養的群體動(dòng)力學(xué)、細菌噬菌體感染的早期檢測、奶酪加工溫度導致的膜變化以及抗生素效應也得到了研究。FC也被建議用于益生菌活菌計數。在細菌指數生長(cháng)期，FC計數和平板計數的一致性得到了確認。其他情況下，FC計數超過(guò)平板計數0.3–1的對數數量級(CFU/g)。FC所需的分析時(shí)間更短，且可自動(dòng)化。但FC無(wú)法區分屬和種，且檢測閾值較高，在牛奶中達到103 –104細胞/ml。
FC也需要一些經(jīng)驗，并且有時(shí)存在假陽(yáng)性。
盡管如此，FC仍然是食品工業(yè)有前景的分析工具。除了計數簡(jiǎn)單外，FC也能提供更多細胞活力的相關(guān)信息。它有益于益生菌產(chǎn)品的質(zhì)控。2005年，ISO發(fā)布了ISO 19344:2015，推薦了用流式細胞術(shù)測定與牛奶和奶制品相關(guān)的發(fā)酵劑、益生菌和發(fā)酵制品中乳酸菌的數量。
測序和組學(xué)的技術(shù)也發(fā)展起來(lái)，用于研究乳酸菌對環(huán)境的反應。組學(xué)也用于鑒定關(guān)鍵標志物，以篩選新的益生菌，并評估其生理狀態(tài)。使用組學(xué)技術(shù)可理解微生物行為和細胞通路，以?xún)?yōu)化工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程。
在食品工業(yè)，PCR已成為檢測致病菌的常規方法，得到了ISO的認可，并發(fā)展為熒光定量PCR。這些來(lái)自比較基因組學(xué)的分析，被用于微生物群體定量、乳制品加工中微生物角色評估或同時(shí)鑒定乳酸菌和益生菌的多個(gè)菌種。PCR也用于評估食品加工過(guò)程中微生物的生理狀態(tài)和活力。有一種區分活菌和死菌的方法是進(jìn)行針對RNA而非DNA的RT-qPCR，但該方法仍然需要標準化。另外一種PCR方法是采用DNA嵌合染料PMA和EMA。它們只進(jìn)入死細胞，能阻止DNA的PCR擴增。采用PMA-PCR和EMA-PCR進(jìn)行益生菌產(chǎn)品中的活菌計數，發(fā)現其結果與平板計數一致性良好。
總之，目前人類(lèi)對于發(fā)酵菌的生物學(xué)知識有助于開(kāi)發(fā)基于菌株特異性生化反應的顯色培養基。這些顯色培養基比傳統培養基更具有鑒別力，更為特異，有助于乳品工業(yè)的微生物控制。流式方法對分析乳品、酸奶和其他發(fā)酵乳中的混合菌群很有前景，可用于質(zhì)控和產(chǎn)品保質(zhì)期的研究。但它需要優(yōu)化，并需去除乳蛋白。不論何種方法，都需與標準方法驗證，并須進(jìn)行方法學(xué)上的評估，以與乳制品企業(yè)的特定需求相一致。
參考文獻
Danièle Sohier, et al. Evolution of microbiological analytical methods for dairy industry needs. Frontiers in microbiology. 2014, 5: 16
HiMedia公司是微生物培養基生產(chǎn)商，其顯色培養基有80多種，涵蓋各個(gè)領(lǐng)域，包括無(wú)動(dòng)物源成分及化學(xué)限定。其生產(chǎn)工藝具有WHO-GMP、ISO9001和ISO13485質(zhì)量體系認證認證，產(chǎn)品有CE和FDA注冊登記，其產(chǎn)品行銷(xiāo)140多個(gè)國家。
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