新guan病毒檢測的另一靶點(diǎn)，助力病毒研究

目前新guan病毒在疫苗研發(fā)和基礎領(lǐng)域獲得了更大的關(guān)注。許多新guan病毒的檢測都針對的是ORF1ab和N基因或E基因，但本文介紹的是新guan病毒的另一個(gè)靶點(diǎn)RdRp基因（即RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基因），用于病毒的檢測，它不用于診斷，只用于研究。

一、新guan病毒RT-qPCR引物/探針（套裝）（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測和分析新guan病毒RNA。它包括3個(gè)成分：

①橙蓋： 2019-nCoV Mix（凍干粉），1管。

此管為新guan病毒引物/探針，可特異性擴增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會(huì )被檢測到【1】【2】。（該引物/探針依據WHO診斷參考實(shí)驗室公布的新guan病毒引物/探針序列而設計【1】。

如要檢測其他冠狀病毒，推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，貨號：271-1100。

②綠蓋： Positive Control RNA（陽(yáng)性對照RNA，凍干粉），1管。

此陽(yáng)性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。

③白蓋： PCR Grade Water（液體），1管。

二、使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級水（③白蓋）復溶，并分裝，避免反復凍融。

該引物/探針應與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反應檢測。

三、檢測樣本需為抽提過(guò)的RNA樣本。

四、新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測，擴增的人RNA酶P基因（過(guò)程對照）用ROX™通道檢測，用以評估樣本的制備質(zhì)量。

五、該方法有三處特別的地方：

1. 靶點(diǎn)特別。依據WHO標準，此引物探針為新guan病毒RdRp基因，而非市面上常見(jiàn)的ORF1ab和N基因或E基因。

2.陽(yáng)性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。

3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲存運輸方便，性能穩定。

4. 適用于科研中，各種來(lái)源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細胞和細菌等。

六、操作注意事項：

該引物/探針應僅由經(jīng)過(guò)培訓的實(shí)驗室人員使用。

始終穿上合適的防護fu和戴一次性手套。

根據樣品類(lèi)型，應謹慎處理所有樣品。請遵循WHO推薦的方法處理樣本。

該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據當地法規丟棄。

七、操作步驟：

步驟1. 試劑制備

①橙蓋2019-nCoV Mix引物探針凍干粉，大速離心5秒鐘，加入525μl PCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

②綠蓋Positive Control RNA陽(yáng)性對照凍干粉，大速離心5秒鐘，加入105μl PCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl 反應體積）

（1）1個(gè)反應需要加入：酶預混液 （自備的紅蓋預混液）10μl ，

橙蓋（復溶的2019-nCoV Mix引物/探針）5μl 

（紅蓋預混液 來(lái)自MB公司的【RNA病毒檢測試劑盒】（RT-qPCR法），

英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號192-0025/-0100/-0250，需單獨購買(mǎi)）

（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。

（3）每個(gè)PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本（抽提后的RNA），

或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對照，或5μl PCR級水作為無(wú)模板對照，或5μl陽(yáng)性對照RNA。

（4）緊扣PCR管，然后短暫離心。

（5）將PCR管放置qPCR儀上，緊上頂蓋。

步驟3. 設置qPCR程序

1個(gè)循環(huán)： 55 ℃，10分鐘

1個(gè)循環(huán)： 94 ℃，3 分鐘

45個(gè)循環(huán)：94 ℃，15秒

58℃，30秒  

步驟4. 啟動(dòng)程序

步驟5. 數據解讀

八、使用注意事項：

• 使用前應認真閱讀說(shuō)明書(shū)。
• 來(lái)自不同批次的試劑不能混合。
• 試劑盒內的試劑應始終作為一個(gè)整體溶解分裝。
• 試劑盒應在效期內使用。
• 每次PCR至少應設置一個(gè)陽(yáng)性對照。每次PCR至少應設置一個(gè)陰性對照和/或一個(gè)無(wú)模板對照。如果實(shí)驗者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實(shí)驗室提供的對照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照，對于確認結果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
• 建議在無(wú)RNA和DNA污染的條件下進(jìn)行RT-PCR，以避免操作過(guò)程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號15-2025，預先清潔實(shí)驗環(huán)境。）
• 盡量減少RNA樣品的凍融次數，同時(shí)避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風(fēng)險。（RNA降解會(huì )極da地限制了RT-qPCR反應的性能）。請確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測。
• 樣本制備過(guò)程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會(huì )降低qPCR的準確性。

九、參考文獻

1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. 

2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.