RNA病毒檢測（RT-qPCR法）（新guan病毒研究推薦）

許多病毒都是RNA病毒，如新型管狀病毒。上通行的檢測方法是RT-qPCR方法。這就離不開(kāi)RT-qPCR mix。下面給您介紹的這款Mix值得關(guān)注，因為它可用于新guan病毒研究檢測（不用于診斷），是其中的一個(gè)重要組分。

一、用途

RNA病毒檢測試劑盒（RT-qPCR法）（英文名：ConviFlex™RT-Taq mix）用于定性檢測和分析RNA病毒和RNA分子，特別適合檢測新guan病毒等此類(lèi)病毒。

二、描述：

1.該試劑盒為實(shí)時(shí)定量qPCR（RT-qPCR）RNA病毒檢測試劑盒。

2. 試劑盒由兩種組分組成：

組分1.  ConviFlex™ RT-Taq Mix的凍干粉包含：MuLV逆轉錄酶、Taq聚合酶及dNTP。

其中MuLV逆轉錄酶，來(lái)自小鼠白血病病毒（M-MuLV）并經(jīng)過(guò)基因修飾。

這里的Taq聚合酶另兼具熱啟動(dòng)功能。

此Taq酶在室溫下，活性被抗體所抑制，當溫度達到70°C以上時(shí)，才會(huì )被*激活。

在70°C 以下時(shí)，由于Taq酶沒(méi)有*活化，因此實(shí)驗不會(huì )產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體。熱啟動(dòng)Taq酶的使用可使PCR具有更高的特異性和靈敏度。

3. 試劑盒使用時(shí)，先用復溶緩沖液溶解凍干粉，再加入自備的RNA模板和引物。

推薦使用MB公司提供的新guan病毒的引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm，貨號271-2100）

4. 該試劑盒適合大多數RT-qPCR體系和qPCR儀類(lèi)型。關(guān)于實(shí)驗使用的jia體積、濃度、溫度和孵育時(shí)間，本文有相應的建議，但實(shí)驗室仍可依據自己的分析要求作相應調整。

三、產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 凍干粉為逆轉錄酶和Taq酶的預混液，將RNA逆轉錄與qPCR擴增兩個(gè)過(guò)程合并，一步完成，減少移液次數、避免交叉污染、操作簡(jiǎn)單，節約時(shí)間。

2. Taq酶具有70°C熱啟動(dòng)功能，顯著(zhù)提高試劑盒的特異性和敏感度。

3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲存運輸方便，性能穩定。

四、需用戶(hù)自己準備的試劑耗材和儀器：

1. 引物、探針（可選）

推薦MB公司提供的新guan病毒的引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm，貨號271-2100）

2. 熒光定量PCR儀（qPCR儀）

3. 無(wú)DNase和RNase的qPCR反應管

4. 離心機

5. 移液器及帶濾芯吸頭（不含DNase和RNase）

6. 用戶(hù)自己的樣品。

五、樣本制備說(shuō)明：

1. 來(lái)自于真核細胞、原核細胞、病毒的RNA以及體外轉錄的RNA，均可用于檢測。

2. 制備的RNA必須不含RT-qPCR抑制劑，例如有機溶劑等。

3. 盡量減少RNA樣品的凍融次數，同時(shí)避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風(fēng)險。（RNA降解會(huì )極da地限制了RT-qPCR反應的性能）

4. 樣本制備過(guò)程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會(huì )降低qPCR的準確性。

建議采用商品化的RNA提取試劑盒預先處理待檢物（如拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細胞和細菌），例如MB廠(chǎng)家的：

【RNA小提試劑盒】（英文名：ExtractNow™ RNA Mini Kit，貨號603-1050）

【病毒RNA提取試劑盒】

(英文名：ExtractNow™ Virus RNA Kit, 貨號611-1010/-1050/-1250)

或使用其他已建立的方法。

六、操作注意事項：

該試劑盒應僅由經(jīng)過(guò)培訓的實(shí)驗室人員使用。始終穿上合適的防護fu和戴一次性手套。

根據樣品類(lèi)型，應謹慎處理所有樣品。該試劑盒不含有害物質(zhì)。殘余物可以根據當地法規丟棄。

七、操作步驟

步驟1. 凍干粉ConviFlex™RT-Taq Mix，大速離心5秒鐘，然后加入260μl復溶緩沖液2×Rehydration Buffer，室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

步驟2.  每個(gè)反應體系為20µl，其中反應mix為15µl。

（1）依據本次試驗樣本數，制備RT-qPCR的反應mix。

1個(gè)反應mix需要：

①ConviFlex™ RT-Taq Mix（即上面復溶的預混液）10µl，

②引物（濃度0.1 - 0.5 µM）

③探針（濃度0.1 - 0.5 µM）

④PCR級水（使每管總體積為15µl）

注：引物和探針的推薦濃度范圍是0.1-0.5 μM。

通常，引物濃度過(guò)高，會(huì )增加引物錯配和非特異RT-PCR產(chǎn)物。然而，當RT-PCR程序運行時(shí)間較長(cháng)或使用簡(jiǎn)并引物時(shí)，則推薦引物濃度升高至1 μM。（注意：若使用簡(jiǎn)并引物，同一RT-PCR分析中，引物之間應具有相同的熔解溫度）

（2）將反應mix渦旋并離心5秒鐘。

（3）每個(gè)PCR管中加入15μl反應mix和5μl樣本（抽提后的RNA），

或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對照，或5μl PCR級水作為無(wú)模板對照，或5μl陽(yáng)性對照。

（4）扣緊PCR管，然后短暫離心。

（5）將PCR管放置qPCR儀上，蓋好蓋。

步驟3. 在qPCR儀上設置反應程序，

示例:  1 cycle   50 °C for 20 min

1 cycle   95 °C for 10 min

45 cycles 95 °C for 15 sec

60 °C for 1 min

 (以上程序僅依據廠(chǎng)家經(jīng)驗，用戶(hù)可根據實(shí)際情況調整溫度和孵育時(shí)間)

步驟4. 啟動(dòng)程序

八、使用注意事項：

1. 使用前應認真閱讀說(shuō)明書(shū)。

2. 來(lái)自不同批次的試劑不能混合。

3. 試劑盒內的試劑應始終作為一個(gè)整體溶解分裝。

4. 試劑盒應在效期內使用。

5. 每次PCR至少應設置一個(gè)陽(yáng)性對照。每次PCR至少應設置一個(gè)陰性對照和/或一個(gè)無(wú)模板對照。如果實(shí)驗者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實(shí)驗室提供的對照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照，對于確認結果的可靠性或用于排除故障非常有意義。

6. 建議在無(wú)RNA和DNA污染的條件下進(jìn)行RT-PCR，以避免操作過(guò)程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號15-2025，預先清潔實(shí)驗環(huán)境。）

7. RNA模板濃度，應依據提取RNA的質(zhì)量、來(lái)源、感興趣基因的相對豐度、以及是否為低拷貝基因，來(lái)調整優(yōu)化。

8. 該試劑盒建議逆轉錄步驟的溫度為50°C。但這個(gè)溫度及持續時(shí)間可根據實(shí)驗室自己的分析要求進(jìn)行優(yōu)化，以增強反應的性能。