PCR試劑盒靈敏度與方法驗證概說(shuō)

PCR方法已廣泛用于科研，在工業(yè)中也有不斷擴大應用的趨勢，它包括檢測一些病原體、檢測支原體污染、檢測細菌污染以及檢測殘留宿主DNA等。

PCR在工業(yè)中的應用主要存在一個(gè)方法驗證的問(wèn)題，尤其是靈敏度的驗證。靈敏度不夠，就會(huì )發(fā)生漏檢。另外，PCR所直接面對的樣本是DNA，而非病原菌或DNA，因此還需要做DNA抽提，這也是要注意的。

下面以支原體PCR檢測為例，略說(shuō)說(shuō)靈敏度的驗證。

藥典規定，生物藥廠(chǎng)的主細胞庫、工作細胞庫、生產(chǎn)終末細胞、檢定細胞、病毒種子批和病毒收獲液、細胞培養相關(guān)材料如培養基、胰酶、臨床治療用干細胞和免疫細胞等，都必須不含支原體。

因此，如能采用PCR檢測支原體并替代藥典方法，還是能節省很多時(shí)間和精力。但PCR方法的驗證需要較為全面。靈敏度驗證是一個(gè)重要方面。靈敏度不夠，就會(huì )發(fā)生漏檢?！稓W洲藥典》第2.6.7章（EP 2.6.7）和《日本藥典》第17版第G3章（JP G3），都規定，對于核酸擴增法（如PCR）檢測支原體，如替代傳統的培養法，都要求檢測限達到10 CFU/ml。

具體驗證可使用10CFU的支原體靈敏度標準品，它一般為凍干粉形式，需要用待測樣本的樣本基質(zhì)（需保證里面不含支原體）來(lái)復溶，再進(jìn)行DNA抽提以及PCR檢測。如檢測的電泳有條帶，或者qPCR檢測后的Ct值小于40，即表明檢測成功。

因此，在選用支原體PCR法檢測來(lái)替代藥典方法時(shí)，需要考慮如下兩個(gè)方面：

第yi步是要使用符合歐洲藥典要求，經(jīng)過(guò)全面驗證的支原體檢測試劑盒，第二部是自我驗證，即確認所用的樣本基質(zhì)對于該試劑盒方法是合適的，并且操作過(guò)程是正確的。小規模的室內驗證通常需要采用三個(gè)不同批次的試劑盒，然后加入10CFU的標準品，做復孔（通常是8個(gè)復孔），并且至少選擇3個(gè)支原體物種進(jìn)行驗證。

有的支原體標準品廠(chǎng)家會(huì )提供CFU與基因拷貝數的比值，以方便二者的換算。因為10CFU只能確定PCR能夠達到的檢測限在10CFU以下，但無(wú)法具體確定靈敏度的數值。帶DNA拷貝數標定的基因組DNA標準品則可進(jìn)一步確定檢測限的數值。

總之，PCR方法很有用，但需要避免假陰性，驗證時(shí)應使用陽(yáng)性對照、陰性對照、無(wú)模板對照和內控對照，以保證PCR反應正常，以及支原體少量存在時(shí)確實(shí)能檢出來(lái)，支原體不存在時(shí)也確保是結果陰性，從而使得PCR方法在工業(yè)應用時(shí)能確保終結果的可靠。

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