提早知道所培養細胞或培養基中是否有細菌污染的一種方法

培養細胞時(shí)，要避免細菌污染。如果存在細菌污染，則培養液一般會(huì )渾濁變黃，對細胞生長(cháng)影響明顯，細胞大多在24小時(shí)死亡。在以細胞大規模培養為基礎的生物藥產(chǎn)業(yè)中，也需要進(jìn)行無(wú)菌檢查。傳統無(wú)菌檢查是采用TSA或TSB培養基培養的方法，一般需要培養14天，觀(guān)察是否有菌落生長(cháng)或溶液渾濁。

現介紹一種通過(guò)PCR進(jìn)行無(wú)菌檢查的方法，當然該方法也是用于研究。即采用德國MB的細菌檢測試劑盒（Onar Bacteria Detection Kit）。它作為PCR試劑盒，針對的是細菌高度保守的16S rRNA序列，陽(yáng)性產(chǎn)物片段大小為467 bp，可跑膠后在紫外燈下觀(guān)察。另包含一個(gè)內控對照，用于檢測PCR反應是否正常，該內控對照條帶為140 bp。

需要注意的是，樣品在檢測前，應在95 °C做熱滅活 5分鐘，之后每個(gè)PCR反應是加5ul。另外，細胞培養液中應不含抗生素，細胞應在不含抗生素的培養基中培養一代，因為抗生素會(huì )使細菌水平保持在檢測限以下（2.4×10的3次方/ml）。另外，檢測時(shí)應做復孔。整個(gè)反應體系為25ul。

該試劑盒可檢測的細菌包括：假單胞菌，放線(xiàn)菌，大腸埃希氏菌，沙雷氏菌，卟啉單胞菌，梭菌，葡萄球菌，鏈球菌，乳桿菌，微球菌，芽孢桿菌，克雷伯菌，沙門(mén)氏菌，腸球菌，分枝桿菌，軍團菌，葡萄球菌，消化鏈球菌。它不檢測真菌、病毒和真核細胞DNA。

典型結果如下：

總之，早期篩查細胞培養時(shí)是否有細菌污染，可以及時(shí)采取措施，而PCR方法更為靈敏、快速和穩定，可以根據實(shí)際情況酌情使用。

 圖. 內控對照顯示PCR反應正常，樣本中無(wú)PCR抑制成分。460bp左右存在目的條帶，提示存在細菌污染。