細胞被支原體污染后，應該怎么辦

 細胞培養過(guò)程中，由于實(shí)驗環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實(shí)驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。

       同時(shí)，由于支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過(guò)電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實(shí)驗者肉眼發(fā)覺(jué)。

       而支原體污染是個(gè)循序的過(guò)程，普通抗生素對其無(wú)效。因此，被支原體污染的細胞會(huì )持續受到影響，導致實(shí)驗數據不準確。

       本期文章中，我們介紹一下細胞被支原體污染后，*清除支原體的方法。

細胞被支原體污染，解決方案 

方法一：確認細胞已被支原體污染，終止試驗，丟棄所有被污染的細胞和耗材。

       重新復蘇細胞，注意選用未被污染的細胞株、血清和培養基，并規范操作。

方法二：對于珍貴的，樣品不可再得的細胞，或價(jià)格昂貴的種子細胞，不但無(wú)法丟棄，而且作為種子細胞，還需要**支原體污染。

      此時(shí)，需選用特異性的支原體殺除劑，清除污染，保護細胞。

      目前世界上you效的方法是是德國的一款專(zhuān)li生物試劑，由Minerva公司生產(chǎn)，品名Mynox®。

      此試劑可在2-3小時(shí)內將支原體主動(dòng)殺除。特別適合細胞保種。

      Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑，加入培養液中，可特異性地與支原體膜結合，改變膜通透性。通過(guò)此生物物理的方法，2～3小時(shí)內，即可把細胞中的支原體殺除掉。因為細胞膜結構與支原體膜不同，故Mynox®不會(huì )與細胞膜結合，因此無(wú)細胞毒性。

       注意：3小時(shí)后，需將此試劑洗脫，將細胞更換到新的培養耗材和培養液中，重新培養。

       此時(shí)，不應使用PCR方法檢測細胞中支原體。由于支原體解體，故PCR結果為假性強陽(yáng)性。

Mynox®殺除支原體功能強大有效，但價(jià)格較貴。

方法三：對于已耗費很多時(shí)間，大量擴增起來(lái)的細胞，或經(jīng)過(guò)基因轉染、體外刺激等大量工作處理過(guò)的細胞，如果發(fā)現細胞被支原體污染了，怎么辦？此時(shí)由于前期工作量巨大，使操作人員無(wú)法丟棄已有細胞。

但由于價(jià)格原因，又無(wú)法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體，

同時(shí)，實(shí)驗人員還需要清除細胞上的支原體污染，讓實(shí)驗得以往下推進(jìn)，以終獲得準確的實(shí)驗數據。

此時(shí)，實(shí)驗者可選用對支原體*的抑制劑，通過(guò)對細胞的前期處理，中期加藥，逐步通過(guò)4代左右的培養，得以將支原體污染*清除，確保試驗順利推進(jìn)，結果準確。

*此類(lèi)試劑眾多，筆者周?chē)膶?shí)驗人做過(guò)很多嘗試，其中效果確切且性?xún)r(jià)比較高的當屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是：通過(guò)抑制支原體增殖中DNA和蛋白的合成，達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield®時(shí)，不需使用鏈青霉素。

操作步驟：

第yi步：研究發(fā)現，98%的支原體污染發(fā)生在細胞間隙。因此，首先要把細胞消化下來(lái)，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復三次。此時(shí)可將細胞上大部分的支原體去除，為進(jìn)一步加藥抑制做好準備。

第二步：培養液中加入1%的ZellShield®，細胞進(jìn)行正常培養。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著(zhù)細胞的換液逐步減少，通過(guò)4代左右的培養，細胞中的支原體基本可被*清除。

此試劑價(jià)格約2800元/50ml，1%濃度使用，可保證大量細胞的實(shí)驗得以順利推進(jìn)。性?xún)r(jià)比較高，但祛除過(guò)程時(shí)間稍長(cháng)。

有些細胞保種中心，當珍貴細胞被支原體污染后，會(huì )將Mynox®和ZellShield®結合使用，效果確切，結果令人滿(mǎn)意。

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