qPCR快檢水中的微生物，第yi步是提DNA

現在檢水多采用微生物培養法，常見(jiàn)所檢的細菌有軍團菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌?，F在，qPCR方法更多的可用于水質(zhì)檢測以及上述微生物的定量檢測。

可以采用德國MB公司的水中微生物DNA提取試劑盒（英文名：AquaScreen® Fast Extract）用于從水樣中提取微生物DNA。該試劑盒遵循ISO/TS 12869:2012的設計要求。提取的DNA可用于下游的PCR或qPCR檢測。

一、適合的樣本：

包括飲用水、浴池水、泳池水及廢水等。

二、工作原理：

該試劑盒采用0.4μm濾膜截獲微生物，然后微生物被加入到濾膜上的離子活性劑和促溶劑裂解。隨后進(jìn)行DNA抽提。

DNA抽提由四步組成：1. 菌體裂解

2. DNA與離心柱的特異結合

3. 祛除殘留污染物和抑制劑

4. DNA的洗脫

整個(gè)過(guò)程大約30分鐘。

三、產(chǎn)品組成：

四、需用戶(hù)自己準備的試劑耗材和儀器：

1. 水過(guò)濾設備（濾器、真空泵等）

2. 無(wú)水乙醇

3. 反應管（1.5ml或2ml）

4. 離心機

5. 恒溫儀

6. 移液器及帶濾芯吸頭（100ml和1000ml）

7. 恒溫箱

五、樣本制備須知：

1. 飲用水、浴池水、泳池水及廢水可作為樣本。樣本性狀會(huì )影響結果的可靠性，并需要與ISO的水樣采集指南一致（ISO Norm 5667-1至5667-10）。

2. 水樣應在2-8°C保存，在采集的2天內檢測。不推薦使用防腐劑，因為會(huì )使菌體裂解，而濾膜只能截留完整的菌體。

3. 若水樣中有懸浮顆?；蚬潭〒]發(fā)性成分，則需先用濾紙過(guò)濾。

4. 樣本不能離心。

5. 該試劑盒所需樣本體積建議為1000ml。樣本體積少應為100ml。

6. 該試劑盒不會(huì )截獲水中游離的DNA。

7. 該試劑盒不能區分“活的可培養微生物”與“活的不可培養微生物”。

六、操作注意事項：

1. 該試劑盒只用于科研，并且應僅由經(jīng)過(guò)培訓的實(shí)驗室人員使用。
2. 所有樣本應視為有潛在危害性，應小心處理。
3. 應始終穿上合適的防護fu，戴一次性手套和護目鏡。
4. 請勿向廢棄液體中加漂白劑或酸性溶液。如有液體濺出，請用合適的去污劑和清水處理。
5. 廢棄物可根據當地法規進(jìn)行處理。
6. Binding Buffer（結合液）含異丙醇和聚乙二醇辛基苯酚醚，易燃、有害、有腐蝕性。
7. Wash Buffer 1（洗液1）含硫氰酸胍，有害、有腐蝕性。

七、樣本制備步驟：

（一）操作步驟概覽

（二）操作步驟詳解

步驟1. 樣本過(guò)濾

1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤濕濾膜。

1.2 將濾膜放置在濾器中，并過(guò)濾必要體積的水樣。

步驟2. 菌體裂解

* 提前準備：預先將恒溫儀設置到70℃，將恒溫箱設置到37℃。

2.1將樣本過(guò)濾后的濾膜翻轉放置到試劑盒提供的Incubation Dish（平皿）中。

2.2 吸取2ml lysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。

2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。

2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。

2.5 將平皿中的400 μl裂解液轉移至Incubation Tube（孵育管），70 °C孵育10分鐘。

2.5a可選項：剩余裂解液可再取400μl用于DNA抽提，以獲得更多的DNA樣本。

2.6 樣本短暫離心，并加入400 μl Binding Buffer（結合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請勿離心樣本，并立即進(jìn)行下一步。

步驟3. DNA提取

* 提前準備：（1）Wash Buffer 1（洗液1）和Wash Buffer 2（洗液2）第yi次使用前，用無(wú)水乙醇復溶（請參見(jiàn)瓶上標簽）

（2）將恒溫儀設置到70℃，并將Elution Buffer（洗脫液）放在上面預熱。

3.1 將步驟2.6中的混合液（~800 μl）轉移到Collection Tube（收集管）內的Spin Column（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。

3.2 離心柱離心≥10000 × g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.2a 可選擇：在步驟2.5a中，多取的一份樣本重復以上操作，不用換離心柱。

3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個(gè)新的收集管中。

3.5大速度離心3分鐘，以去除殘留的洗液2。

3.6棄掉收集管。將離心柱插入到試劑盒提供的Sample Storage Tube（樣本保存管）中。

3.7吸取60μl已70℃預熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應全部覆蓋洗脫液。

3.8室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。

3.9樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲存在2~8℃，可存放1周。長(cháng)期儲存是在≤-18℃。

八、樣本中的細菌數量計算

樣本中的細菌定量需使用PCR定量標準品和qPCR檢測試劑盒（推薦使用德國MB的PCR定量標準品和AquaScreen®qPCR檢測試劑盒，詳見(jiàn)“九、水中細菌精zhun測定，還需要的相關(guān)試劑”）

計算公式：基因組拷貝數/反應 × 比例因子× 校正因子× （1000/樣本體積（ml））

= 微生物數量/升

注：

1. 樣本中的基因組拷貝數：可通過(guò)標準曲線(xiàn)定量

2. 比例因子：取1份400ml裂解液，比例因子=5

取2份400ml裂解液，比例因子=2.5

取3份400ml裂解液，比例因子=1.67

3. 校正因子：60ml洗脫液中取10ml用于qPCR反應，校正因子=6

九、水中細菌精zhun測定，還需要的相關(guān)試劑：

總之，傳統水質(zhì)檢查需要2-3天，qPCR法只需要2-3個(gè)小時(shí)，提取DNA只需要大約半個(gè)小時(shí)，更精zhun，更快捷。以上信息供參考，感謝締一生物提供相關(guān)內容。