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細胞命運轉變以及響應外界信號的過(guò)程中會(huì )改變細胞類(lèi)型特異（cell-type-specific）的基因表達，而基因表達的豐度(total RNA level)是由mRNA轉錄、加工、降解等過(guò)程共同決定的。
在含有多種細胞類(lèi)型的復雜組織和系統中，在單細胞水平準確測定這些 mRNA動(dòng)態(tài)變化過(guò)程對于理解基因表達調控的重要性不言而喻。
傳統的mRNA代謝標記技術(shù)利用尿苷類(lèi)似物4-硫尿苷（4sU）可以有效的標記新生mRNA，但是技術(shù)上的局限性不能達到單細胞分辨率；而常規單細胞轉錄組測序技術(shù)雖然可以揭示不同細胞類(lèi)型的穩態(tài)轉錄組，但是不能準確分辨特定時(shí)間里新生成的和已有的mRNA，因此用于定量研究細胞類(lèi)型特異的mRNA動(dòng)態(tài)調控機制十分困難。
為了應對這一挑戰，美國賓夕法尼亞大學(xué)吳昊實(shí)驗室開(kāi)發(fā)了一種高通量檢測單細胞mRNA動(dòng)態(tài)變化的新方法， scNT-seq（全稱(chēng)single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）。
該方法創(chuàng )新性的整合了mRNA代謝標記 (metabolic labeling)，基于液滴微流控（droplet microfluidics）的高通量單細胞轉錄組分析技術(shù)和近開(kāi)發(fā)的4sU化學(xué)轉化反應 （chemically recode 4sU to cytosine analog）；在數據分析方面，作者構建了基于unique molecular identifier (UMI) 的統計模型來(lái)更加準確地分析單細胞水平上新生成的mRNA的比例。
北京時(shí)間2020年8月31日晚23時(shí)，Nature Methods雜志在線(xiàn)發(fā)表了文章 “Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq”。
作者應用這一技術(shù)解析了小鼠神經(jīng)元快速激活過(guò)程中的單細胞基因調控網(wǎng)絡(luò )并預測細胞狀態(tài)變化軌跡，他們還進(jìn)一步研究了不同胚胎干細胞狀態(tài)轉換過(guò)程中的mRNA動(dòng)態(tài)變化的調控機制。
scNT-seq具體技術(shù)流程如下：首先將4sU添加到培養基中用來(lái)標記細胞中新生成的mRNA（圖1第1步）。為了在單細胞轉錄組中區分含有4sU標記的轉錄本，將4sU化學(xué)轉化反應整合到液滴微流控 (Drop-seq) 流程中（圖1第2-4步）。
由于捕獲mRNA的barcoded beads具有區分不同轉錄本的UMI序列，相比較沒(méi)有UMI的單細胞分析技術(shù)（e.g. scSLAM-seq），該方法不僅可以消除由于PCR擴增帶來(lái)的誤差，而且相對于單個(gè)mRNA分子而言能增加T-to-C的覆蓋度（圖1第5-8步）。
后，利用基于UMI的二項式混合分布來(lái)準確估計每個(gè)細胞中單個(gè)基因的新生轉錄本。（圖1第9步）
圖2 利用scNT-seq技術(shù)研究小鼠大腦皮層神經(jīng)元中神經(jīng)活性調控的轉錄動(dòng)態(tài)。
前人的研究表明，神經(jīng)元激活后可以快速誘導（幾分鐘到幾小時(shí)內）幾百個(gè)特異基因表達，這些基因被稱(chēng)為神經(jīng)活性調節的基因（Activity-regulated genes， ARGs）。
利用ARGs被神經(jīng)活性快速誘導而在靜息狀態(tài)下幾乎不表達的特點(diǎn)，可用其評估scNT-seq技術(shù)檢測新生成mRNA的可靠性。作者用4sU標記原代培養的小鼠大腦皮層神經(jīng)細胞，其間用KCl激活這些細胞（15-120分鐘）（圖2a）。
作者首先將大腦皮層神經(jīng)元聚類(lèi)成不同細胞類(lèi)型，包括興奮性神經(jīng)元（Ex）、抑制性神經(jīng)元 (Inh)、神經(jīng)元前體細胞（NP）等（圖2b）。接下來(lái)他們分析了不同細胞類(lèi)型中，ARGs基因中（如Jun和Npas4基因，圖2c）新（new RNAs，產(chǎn)生于4sU標記的2小時(shí)內）和舊（old RNAs，產(chǎn)生于2小時(shí)前）轉錄本在不同細胞類(lèi)型中的表達水平。
這些ARGs的new RNAs在不同細胞類(lèi)型中有不同程度的響應，而old RNAs沒(méi)有明顯響應（合成于4sU標記和神經(jīng)元激活前），說(shuō)明scNT-seq可以準確區分新舊轉錄本。
在準確區分新、舊轉錄本的基礎上，作者運用新近開(kāi)發(fā)的Dynamo算法程序在興奮性神經(jīng)元中進(jìn)行了基于mRNA代謝標記的RNA velocity分析（圖2d右側），能準確捕獲神經(jīng)元激活早期（0 – 15min）和晚期（30 – 120 min）的變化。
相較之下，傳統的RNA velocity利用已拼接（無(wú)內含子）和未拼接（有內含子）的轉錄本信息來(lái)間接地預測細胞中基因表達的變化趨勢。
由于Jun， Fos等早期響應基因內含子長(cháng)度較短，基于內含子/外顯子定量的傳統RNA velocity方法無(wú)法準確估計這些基因的動(dòng)態(tài)變化，因此無(wú)法鑒定到神經(jīng)元激活早期（0 – 15min）的變化 (圖2d左側）。
而基于新生成轉錄本的RNA velocity能夠直接利用實(shí)驗準確定量的新、舊轉錄本的信息，推測mRNA的動(dòng)態(tài)變化，不受基因結構（內含子比例）影響，兼具準確性和適用性。
細胞中RNA的豐度由轉錄、加工、降解等過(guò)程共同決定，準確測定細胞群體中稀有或動(dòng)態(tài)變化的細胞類(lèi)型中mRNA合成和降解速率是一個(gè)重要而充滿(mǎn)挑戰的問(wèn)題。
前人的研究表明，小鼠胚胎干細胞存在不同的干細胞狀態(tài)，其中大約1%的細胞會(huì )自發(fā)轉變?yōu)榫哂懈叻只瘽摿Γ╰otipotent）的“2C-like”狀態(tài)（2-cell embryos like state）。
作者通過(guò)pulse-chase的標記策略結合scNT-seq技術(shù)測定了2616個(gè)基因在不同細胞狀態(tài)中的降解速率（half-life，圖3a，b）。
結合4小時(shí)4sU標記實(shí)驗，作者測定了445個(gè)差異表達基因的合成和降解速率。根據mRNA合成速率和降解速率在不同細胞狀態(tài)間變化的趨勢，這些基因可以劃分為3種不同的mRNA豐度調節策略（圖3c）。
有意思的是，即使采用同一種調控策略的基因，mRNA合成和降解對于不同基因mRNA豐度調節的貢獻也不盡相同。例如Tet1和Lefty2基因都采用“Destabilizing”策略（mRNA合成和降解速率同向變化），但是Tet1基因主要通過(guò)降低合成速率（synthesis rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度，而Lefty2基因主要通過(guò)提高降解速率（degradation rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度（圖3c）。
總的來(lái)說(shuō)，scNT-seq是一種能在單細胞水平準確定量新生轉錄本的新技術(shù)。和已有的單細胞代謝標記分析方法[ref 3]相比，這項新技術(shù)兼具高準確度，高通量和低成本等優(yōu)勢。
因此，scNT-seq與Jay Shendure實(shí)驗室的曹俊越博士新近開(kāi)發(fā)的sci-fate技術(shù)，都能夠廣泛應用于分析大量單細胞在細胞命運決定和分化，外界信號響應，及疾病模型等動(dòng)態(tài)過(guò)程中mRNA表達調控等相關(guān)的重要生物學(xué)問(wèn)題。
生命科學(xué)實(shí)驗中，離不開(kāi)胎牛血清，胎牛血清 在細胞培養中的作用：
1. 提供對維持細胞指數生長(cháng)的激素，基礎培養基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養物，以及主要的低分子營(yíng)養物。
2. 提供結合蛋白，能識別維生素、脂類(lèi)、金屬和其他激素等，能結合或調節它們所結合的物質(zhì)活力。
3. 有些情況下結合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結合，起到解毒作用。
4. 是細胞貼壁、鋪展在塑料培養基質(zhì)上所需因子來(lái)源。
5. 起酸堿度緩沖液作用。
6. 提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。
7. 參與細胞凍存。
在細胞培養中，胎牛血清加入基礎培養基的濃度大多為5%～20%（常見(jiàn)見(jiàn)為10%）的。具體到不同試驗，應依據文獻報導，或細胞類(lèi)型或基礎培養基的成分來(lái)確定標準濃度。
胎牛血清應在-20℃儲存，運輸應干冰冷鏈運輸，避免反復凍融，確保血清中因子活性不受影響，保證血清優(yōu)良品質(zhì)。
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