細胞總培養不好，你考慮過(guò)是支原體在作亂嗎

實(shí)驗室里總會(huì )有各式各樣的細胞需要培養，養細胞的會(huì )發(fā)生一些囧事：不做實(shí)驗的時(shí)候，細胞長(cháng)得老快了；一到做實(shí)驗的時(shí)候，自家的細胞好像吃了瞌睡藥一樣，昏昏欲睡，死活長(cháng)不起來(lái)。

• 細胞生長(cháng)緩慢；
• 細胞變形；
• 碎片增加；
• 懸浮細胞容易成團；
• 培養基提前變色；
• 鏡下發(fā)現有小黑點(diǎn)；

如果排除了其他試劑選擇不當、細胞株老化、細菌污染……原因，而仍有上述一種或幾種情況，則高度提示：細胞可能出現了支原體污染。據報道，細胞培養中發(fā)生支原體污染的機率較高，會(huì )達到70%左右，常規抗生素的使用對支原體幾乎無(wú)效。

那么，支原體污染，對細胞培養有什么危害呢？

 

支原體穿透真核細胞表面 大量支原體聚集在真核細胞表面（掃描電鏡照片）

細胞被支原體污染，解決方案：

方法一：確認細胞已被支原體污染，終止試驗，丟棄所有被污染的細胞和耗材。

重新復蘇細胞，注意選用未被污染的細胞株、血清和培養基，并規范操作。

方法二：對于珍貴的，樣品不可再得的細胞，或價(jià)格昂貴的種子細胞，不但無(wú)法丟棄，而且作為種子細胞，還需要**支原體污染。

此時(shí)，需選用特異性的支原體殺除劑，清除污染，保護細胞。

目前世界上有效的方法是是德國的一款生物試劑，由Minerva公司生產(chǎn)，品名Mynox®。

此試劑可在2-3小時(shí)內將支原體主動(dòng)殺除，但對細胞無(wú)毒害作用。特別適合細胞保種。

Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑，加入培養液中，可特異性地與支原體膜結合，改變膜通透性。通過(guò)此生物物理的方法，2～3小時(shí)內，即可把細胞中的支原體殺除掉。因為細胞膜結構與支原體膜不同，故Mynox®不會(huì )與細胞膜結合，因此無(wú)細胞毒性。

注意：3小時(shí)后，需將此試劑洗脫，將細胞更換到新的培養耗材和培養液中，重新培養。

此時(shí)，不應使用PCR方法檢測細胞中支原體。由于支原體解體，故PCR結果為假性強陽(yáng)性。

具體操作流程見(jiàn)下圖：

 

Mynox®祛除貼壁細胞中支原體的流程圖

Mynox®殺除支原體功能強大有效，但由于價(jià)格昂貴，上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右，使得應用于細胞保種的數量受到價(jià)格的限制。

方法三：對于已耗費很多時(shí)間，大量擴增起來(lái)的細胞，或經(jīng)過(guò)基因轉染、體外刺激等大量工作處理過(guò)的細胞，如果發(fā)現細胞被支原體污染了，怎么辦？此時(shí)由于前期工作量巨大，使操作人員無(wú)法丟棄已有細胞。

但由于價(jià)格原因，又無(wú)法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體，

同時(shí)，實(shí)驗人員還需要清除細胞上的支原體污染，讓實(shí)驗得以往下推進(jìn)，以終獲得準確的實(shí)驗數據。

此時(shí)，實(shí)驗者可選用對支原體*的抑制劑，通過(guò)對細胞的前期處理，中期加藥，逐步通過(guò)4代左右的培養，得以將支原體污染*清除，確保試驗順利推進(jìn)，結果準確。