如何判斷知道細胞被支原體污染了？

發(fā)生污染，既耽誤時(shí)間又是一個(gè)災難，熟練的無(wú)菌操作能避免許多問(wèn)題，但早期檢測污染是一種可以預警的方法。對于培養箱中的每瓶細胞都要注意觀(guān)察，要養成習慣，每次打開(kāi)培養箱時(shí)，迅速看看有沒(méi)有發(fā)生污染。

細菌、酵母、真菌、霉菌、支原體以及其他的培養細胞都可能引起污染。

怎樣識別污染

一、肉眼觀(guān)察，把培養瓶或培養皿拿起來(lái)，對著(zhù)光線(xiàn)檢查。

• 渾濁情況。即使細胞密度很高，培養基也應該是透明的。輕輕移動(dòng)或晃動(dòng)培養瓶，觀(guān)察培養基的渾濁或懸浮情況，一些霉菌可能會(huì )在培養基的表面形成菌落。

• 培養基顏色的變化。酸性條件下，加了酚紅的培養基會(huì )由紅變黃，而堿性條件下會(huì )變成紅紫色。細菌污染常常會(huì )使培養基變成黃色，真菌污染會(huì )使培養基變成深紫紅色。

• 聞！當然不能打開(kāi)瓶子去聞，把鼻子貼在瓶口聞，許多污染發(fā)生以后都會(huì )散發(fā)出易察覺(jué)的、特殊的氣味，甚至一打開(kāi)培養箱門(mén)就聞到了。

二、顯微觀(guān)察。在倒置顯微鏡下，先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物鏡（總放大倍數為400) 觀(guān)察細胞培養皿或培養瓶中的細胞：

• 其他有機體。在低倍鏡下，真菌的菌絲體成長(cháng)棒狀，并橫穿整個(gè)視野，還可以觀(guān)察到酵母，有時(shí)呈小圓球形，有時(shí)還有芽。

在高倍鏡下可以觀(guān)察到細菌，它們可能是棒狀或球狀，單獨成鏈或成團存在，它們也可能和細胞混在一起，并且明顯處于細胞內部，有些細胞可能已經(jīng)裂解變得模糊。觀(guān)察時(shí)可能每?jì)蓚€(gè)視野才出現一個(gè)污染（當然也算被污染了?。?，而且可能污染物是可以運動(dòng)的。

• 損傷細胞。感染會(huì )殺死細胞，可能導致每個(gè)細胞都裂解和／或細胞層從附著(zhù)物上*剝離，更可能的是細胞變得不規則（或大或?。?，在低倍鏡下是黑色的粒狀

懸浮培養細胞比貼壁培養細胞更加難以顯微觀(guān)察，尤其是高倍顯微鏡下。

• 將培養瓶或培養皿放在顯微鏡的載物臺上，靜置一會(huì )。

• 將焦距對準器皿的底部，觀(guān)察那些輕微附著(zhù)的細胞，因為它們可能已經(jīng)接觸到了微生物。

• 對準整個(gè)培養瓶焦距，當發(fā)現細胞的時(shí)候，用細聚焦調節旋鈕調節，仔細檢查周?chē)呐囵B基有沒(méi)有污染發(fā)生。

如果你不能確定是否發(fā)生了污染

• 制作濕涂片或染色片。取1 ml 培養基離心，用50 μl 培養基或緩沖液重新懸浮細胞，滴一滴到載玻片，蓋上蓋玻片制成濕涂片；或涂片、固定并染色（甲基蘭或革蘭氏染液），在高倍鏡下觀(guān)察。

• 將細胞在營(yíng)養培養基或瓊脂培養基上劃線(xiàn)， 37℃培養3 天。如果有菌落，那么細胞被污染了。

• 取1 ml 的細胞培養液至無(wú)菌的微量離心管中， 37℃培養3 天。觀(guān)察到渾濁物，做濕涂片顯微鏡觀(guān)察。

Mynox®殺除支原體功能強大有效，但價(jià)格較貴。

方法三：對于已耗費很多時(shí)間，大量擴增起來(lái)的細胞，或經(jīng)過(guò)基因轉染、體外刺激等大量工作處理過(guò)的細胞，如果發(fā)現細胞被支原體污染了，怎么辦？此時(shí)由于前期工作量巨大，使操作人員無(wú)法丟棄已有細胞。

但由于價(jià)格原因，又無(wú)法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體，

同時(shí)，實(shí)驗人員還需要清除細胞上的支原體污染，讓實(shí)驗得以往下推進(jìn)，以最終獲得準確的實(shí)驗數據。

此時(shí)，實(shí)驗者可選用對支原體有效的抑制劑，通過(guò)對細胞的前期處理，中期加藥，逐步通過(guò)4代左右的培養，得以將支原體污染*清除，確保試驗順利推進(jìn)，結果準確。

此類(lèi)試劑眾多，筆者周?chē)膶?shí)驗人做過(guò)很多嘗試，其中效果最確切且性?xún)r(jià)比較高的當屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是：通過(guò)抑制支原體增殖中DNA和蛋白的合成，達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield®時(shí)，不需使用鏈青霉素。

 

操作步驟：

第一步：研究發(fā)現，98%的支原體污染發(fā)生在細胞間隙。因此，首先要把細胞消化下來(lái)，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復三次。此時(shí)可將細胞上大部分的支原體去除，為進(jìn)一步加藥抑制做好準備。

第二步：培養液中加入1%的ZellShield®，細胞進(jìn)行正常培養。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著(zhù)細胞的換液逐步減少，通過(guò)4代左右的培養，細胞中的支原體基本可被*清除。