支原體檢測中「方法驗證」的必要性

核酸擴增技術(shù)與支原體檢測

自1988年以PCR為代表的核酸擴增技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，該技術(shù)已廣泛應用于科研和臨床，但由于標準化的建立需要一定的時(shí)間，因此用于生物制藥則相對較晚。

國外已有不少藥廠(chǎng)將PCR或qPCR用于工業(yè)放行檢測中的支原體檢查。PCR或qPCR的靈敏度、特異性、適用性和可靠性具有達到藥典標準的潛在可能。但需要按步驟和程序開(kāi)展方法驗證。

支原體檢測方法驗證

有研究人員指出，有些PCR檢測法，在反應條件及引物設計上，仍需不斷改良以提高其檢測效率。曾有研究人員，用半巢式PCR檢測70份支原體污染的樣本（主要為生物制品生產(chǎn)用細胞基質(zhì)），結果只檢出60份，說(shuō)明PCR要應用于工業(yè)檢測支原體，其首要因素是要提高檢測限。

傳統支原體檢查方法是培養法和指示細胞培養法，并為藥典所認可和收錄。近年來(lái)，支原體qPCR檢測在工業(yè)領(lǐng)域的應用越來(lái)越多，但在項目申報前，先需要進(jìn)行方法學(xué)驗證，依據藥典，在檢測限、特異性和耐用性方面達到要求后，才能替代傳統的檢查方法。

好物推薦

支原體qPCR檢測試劑盒因其操作時(shí)間短（僅需2-3小時(shí)）、靈敏度和特異性高而廣受科研人員青睞。

目前國外藥廠(chǎng)放行檢測（product release testing）采用的較多的是德國Minerva Biolabs(簡(jiǎn)稱(chēng)MB)公司的Venor® Gem qEP (qPCR法)和Venor® Gem Classic(常規PCR法)。Venor® Gem qEP由于無(wú)須跑膠，且能定量，因而使用更為便捷。

MB Venor® Gem qEP 試劑盒的特點(diǎn)：

1）使用靈活

* 與幾乎所有商用循環(huán)儀兼容

* 可選擇常規PCR或實(shí)時(shí)熒光定量PCR

2）高性能

* 高耐用性、高靈敏度和高特異性（>100種支原體物種可檢測）

* 符合EP 2.6.7 / USP <71> / JP G3標準。提供內部擴增對照，

用于過(guò)程監測。有產(chǎn)品驗證報告

3）使用方便

* 預先分裝PCR mix（25個(gè)反應），保證長(cháng)期穩定性

* 組分為凍干粉形式，使運輸與存儲更簡(jiǎn)單

* 探針檢測，結果清晰（qPCR）

可考慮的標準品需要經(jīng)過(guò)嚴格標定。需考慮有國際聲譽(yù)和質(zhì)控報告的標準品廠(chǎng)家。下面介紹某廠(chǎng)家標準品類(lèi)別如下：

配套用于過(guò)程驗證和檢測的標準品（EP2.6.7/USP<71>/JP G3）：

* 10CFU™靈敏度標準品，包括所有EP和JP列舉的支原體物種

* 100CFU™靈敏度標準品

* 支原體和細菌基因組DNA（特異性驗證用）

* PCR定量標準品（108拷貝DNA/管）