細胞實(shí)驗，請對『內毒素』特別關(guān)注！

細胞培養與內毒素

我們常說(shuō)，細胞培養過(guò)程中，在選購血清的時(shí)候，一定要關(guān)注血清的“內毒素指標"，同時(shí)，內毒素含量也是劃分血清等級的標準之一。

(目前，由于同一廠(chǎng)家，不同批次的血清，內毒素數值也可能有較大差異，因此很多血清廠(chǎng)家在名稱(chēng)上已不注明級別。但使用者仍可通過(guò)檢測報告，自行甄別挑選。)

那這血清中內毒素的高低對細胞培養會(huì )有啥影響??？為什么選血清要選內毒素含量低的呢？

所以今天我們就來(lái)聊聊，細胞培養中血清的內毒素問(wèn)題。

01

人體對細菌內毒素極為敏感

極微量（1-5ng/kg，而1ng≈2.5EU）內毒素就能引起體溫上升，發(fā)熱反應持續約4小時(shí)后逐漸消退。

自然感染時(shí)，因革蘭氏陰性菌不斷生長(cháng)繁殖，同時(shí)伴有陸續死亡、釋出內毒素，故發(fā)熱反應將持續至體內病原菌*消滅為止。

內毒素引起發(fā)熱反應的原因是內毒素作用于體內的巨噬細胞、中性粒細胞等，使之產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等細胞因子，這些細胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調節中樞，促使體溫升高發(fā)熱。

由于內毒素是細菌死亡裂解或自溶引起的，因此環(huán)境中大量存在內毒素。但是如果在細胞培養過(guò)程中，出現了大量?jì)榷舅?，而細胞要用于某些疾病的治療，回輸人體，這是萬(wàn)萬(wàn)不行的。

02

內毒素對細胞培養的影響

細胞遺傳代謝的影響

此前，有人做過(guò)實(shí)驗，來(lái)觀(guān)察內毒素對細胞培養的影響，記錄的影響包括：刺激白細胞培養物產(chǎn)生組織因子、激活鼠巨噬細胞，以及通過(guò)極低水平（低于 1 ng/mL）的內毒素抑制鼠類(lèi)紅細胞集落形成等一系列指標。

隨后，發(fā)表了許多關(guān)于內毒素對體外細胞功能和生長(cháng)影響的論文。

Morris等人發(fā)現（1），只需暴露 6 小時(shí)，低至 0.5 ng/mL 的內毒素水平可以增加馬腹膜巨噬細胞中IL-6的產(chǎn)生。Mattern等人發(fā)現（2）， 100 ng/mL 內毒素可以刺激人類(lèi) T 細胞的增殖及其淋巴因子的產(chǎn)生，但這種刺激需要與先前暴露于內毒素的單核細胞直接物理接觸。Sibley等人報道，10 到 200 ng/mL 內毒素刺激鼠 B 細胞腫瘤細胞系 (70Z/3) 完成 IgM 的產(chǎn)生，然后在細胞表面表達（3）。

從現有的研究可以看出，內毒素對于細胞培養影響還是很大的：

• 改變細胞外形

• 活化細胞，產(chǎn)生訊息傳遞物質(zhì)

• 抑制酶活性

• 抑制人工受精的成功率等

血清中內毒素含量過(guò)高，更容易導致細胞“亞健康"，造成數據不準，或細胞狀態(tài)不良、老化、甚至死亡，導致試驗中斷失敗。所以要盡量選擇內毒素低的血清。

對實(shí)驗結果的影響

內毒素會(huì )加速細胞衰老、凋亡，細胞提前死亡，影響實(shí)驗結果，導致實(shí)驗數據產(chǎn)生波動(dòng)。

參考文獻：

1.Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992).

2.Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994).

3.Sibley, C.H.,Terry, A. and Raetz, C.R.H.Induction of K Light Chain Synthesis in 70Z/3 BLymphoma Cells by Chemically Defined Lipid A Precursors. J. Biol. Chem.263:5098-5103 (1988).

03

選擇內毒素低的優(yōu)質(zhì)血清

一般來(lái)說(shuō)，細胞或組織培養過(guò)程中內毒素污染源通常來(lái)自于血清、培養液及外加藥物配制用水等。

所以選擇內毒素含量低的優(yōu)質(zhì)血清就顯得尤為重要。

以下幾類(lèi)情況更應關(guān)注內毒素的影響：

1、養干細胞時(shí)，干細胞對內毒素非常敏感，如果血清中內毒素≥3EU/ml時(shí)，干細胞很容易死亡。

2、養免疫細胞時(shí)，過(guò)高的內毒素可誘導免疫細胞釋放炎癥因子，抑制小鼠紅細胞集落的形成等。

3、基因敲除相關(guān)的細胞實(shí)驗，培養的細胞要盡可能保持其原始狀態(tài)，任何引導細胞衰老或凋亡的試劑，都會(huì )讓后續的實(shí)驗結果“失之毫厘，謬以千里"。在準備血清和其他試劑時(shí)，選擇極低的內毒素（最好≤1EU/ml），對實(shí)驗至關(guān)重要。

4、原代培養、雜交瘤融合、細胞轉染，或者肝細胞、神經(jīng)細胞、內皮等難養細胞的擴增，這些都需要挑選好的血清給細胞以有力支持。因此，挑選更低的內毒素，是保證實(shí)驗順利的第一步。

5、實(shí)驗室有些細胞，需要長(cháng)期培養、長(cháng)期凍存，或者經(jīng)常復蘇、經(jīng)常培養的，血清會(huì )經(jīng)?；蜷L(cháng)時(shí)間作用于細胞。為保證細胞的健康，都應該選用更低內毒素的血清，以避免內毒素長(cháng)久對細胞的毒性影響。

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內毒素≤3EU/ml

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