細胞培養的基本步驟有哪些？

細胞培養技術(shù)指的是細胞在體外條件下的生長(cháng)，在培養的過(guò)程中細胞不再形成組織（動(dòng)物）。培養物是單個(gè)細胞或細胞群。細胞在培養時(shí)都要生活在人工環(huán)境中，由于環(huán)境的改變，細胞的移動(dòng)或受一些其他因素的影響，培養時(shí)間加長(cháng)，傳代導致細胞出現單一化型。

一、細胞復蘇

將凍存細2113胞從液氮5261中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融4102化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱1653的DMEM*培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10mlDMEM培養基清洗，棄上清液。加入10mlDMEM*培養基，輕輕吹打，接種于10cm盤(pán)中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時(shí)．去培養基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1mlDMEM*培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。

加入10mlPBS清洗細胞培養盤(pán)，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10mlPBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進(jìn)行計數，按照1×106/盤(pán)接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%～90%時(shí)，去培養基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM*培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細胞培養盤(pán)，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過(guò)夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。

凍存液的配制：70%的*培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

科研實(shí)驗中，細胞的體外培養一直是一個(gè)重要環(huán)節。細胞要養好，就要用好血清，如Ausbian®特級胎牛血清，它適合各種細胞培養，尤其適合難養細胞，如：干細胞、肝細胞，神經(jīng)細胞，原代培養、細胞融合、轉染細胞等