支原體常規檢測的幾種方法

被廣泛使用的方法

基于Venor®Gem qEP經(jīng)典法試劑盒的qPCR檢測法，目前使用較為廣泛，擁有高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，還可以選配支原體和細菌DNA、支原體絕對定量標準品，來(lái)進(jìn)行特異性驗證、定量檢測。

經(jīng)典法pro版

基于Venor®Gem qOneStep一步法試劑盒的qPCR檢測法，是經(jīng)典法的升級版本，包含經(jīng)典法所有優(yōu)點(diǎn)。另外，內控已配置好，更加省時(shí)省力。

傳統認為的金標準

分離培養法被認為是支原體檢測的金標準，準確率比較高，但培養周期長(cháng)，而且對于一些特定支原體無(wú)法培養。

操作步驟多但簡(jiǎn)單

DNA染色法檢測支原體雖然操作步驟較多，包含指示細胞培養，上清液共培養、染色等多個(gè)過(guò)程，但并不復雜，對技術(shù)要求相對沒(méi)有那么高。

今天我們就來(lái)介紹最后兩種常見(jiàn)檢測法

ELISA法和PCR法

廢話(huà)不多說(shuō)

我們直接上干貨

ELISA法

首先我們先來(lái)簡(jiǎn)單了解一下ELISA：

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)寫(xiě)ELISA或ELASA）指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進(jìn)行免疫反應的定性和定量檢測方法。根據免疫吸附劑、酶聯(lián)物、結合物這些試劑的來(lái)源、樣本情況，檢測具體條件，可以分為夾心法、競爭法、間接法等不同類(lèi)型。

支原體檢測過(guò)程中用到的ELISA，一般采用的是夾心法，針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體，來(lái)檢測培養物中是否含有支原體。

先用純化過(guò)的支原體抗體包被微孔板，制成固相抗體。

往微孔板中依次加入支原體（Mycoplasmal），再與 HRP（一種雙功能試劑，通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物）標記的支原體抗體結合，形成抗體 -抗原-酶標抗體復合物。

經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。

最后用酶標儀分析結果：

顏色的深淺和樣品中的支原體（ Mycoplasmal）呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm波長(cháng)下測定吸光度（ OD值），通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中支原體濃度。整個(gè)過(guò)程時(shí)間比較短，一般三四個(gè)小時(shí)就能出結果。

整個(gè)過(guò)程除取樣外，還包括標準品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、結果分析，步驟比較多，且很多步驟都需要有一定經(jīng)驗的人操作才能保證準確性，因此對技術(shù)要求比較高。

另外，由于依賴(lài)抗體的特性，該方法能夠檢測的支原體種類(lèi)比較有限，對于沒(méi)有抗體的支原體，ELISA就無(wú)能為力了。

PCR法

常規PCR法：

根據支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設計引物，對待檢樣本DNA進(jìn)行擴增，通過(guò)對擴增產(chǎn)物的大小分析作出判斷。

以Venor®Gem OneStep支原體常規PCR檢測試劑盒為例，簡(jiǎn)單介紹一下實(shí)驗流程。

樣本處理

與qPCR類(lèi)似

取適量待檢測樣品上清

95℃孵育10min

以對樣品進(jìn)行穩定化處理

試劑制備

離心?按比例混合?靜置?混勻

PCR體系建立

設置好陰性對照、陽(yáng)性對照、重復孔

扣緊蓋子混勻

啟動(dòng)PCR反應

根據使用說(shuō)明設置好程序

電泳結果分析

191bp為內控對照條帶，表明PCR反應正常。

當樣本存在支原體污染時(shí)，由于內控對照與支原體DNA存在競爭，內控對照條帶變弱（例如支原體DNA＞1000拷貝）。

陽(yáng)性對照中支原體DNA＞10000拷貝，內控對照條帶會(huì )*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結果。

如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制，則內控對照條帶變弱（和陰性對照相比），此時(shí)應先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測。

常規PCR的優(yōu)點(diǎn)就是檢測時(shí)間短：2-3小時(shí)即可出結果、靈敏度高、特異性強、操作簡(jiǎn)單。

缺點(diǎn)也很明顯，用PCR檢測已經(jīng)進(jìn)行過(guò)支原體滅活的樣品時(shí)，由于支原體DNA依然存在，所以此時(shí)PCR結果仍為陽(yáng)性，說(shuō)明該樣品曾經(jīng)感染過(guò)支原體。

另外不同廠(chǎng)家的試劑盒差異比較大，需要謹慎選擇。

ELISA法

至此，幾種常規的檢測方法都已經(jīng)介紹給大家啦，給大家做了個(gè)小總結，供參考。有些單一的檢測方法并不嚴謹，需要結合實(shí)驗情況，聯(lián)合使用多種方法進(jìn)行檢驗，確保結果的可信度。

培養法是金標準，但是周期長(cháng)，有些支原體還檢測不到；

染色法普適性強，操作簡(jiǎn)單，但是對于支原體數量有要求，也容易有假陽(yáng)性假陰性；

ELISA法耗時(shí)短，但是對操作人員要求比較高，需要獲得相應抗體才可以進(jìn)行試驗；

常規PCR法，基本包含了上面所有的優(yōu)點(diǎn)，但是不能分辨支原體的死活，用到的試劑盒也是良莠不齊；

qPCR法，涵蓋上述所有優(yōu)點(diǎn)，但是對實(shí)驗人員有一定的經(jīng)驗要求，因此該方法目前也是十分常用的檢測手段。

不同的是，“一步法"試劑盒中，直接將內控添加到預混液中，使用起來(lái)更加方便、節省時(shí)間。

下面我們就來(lái)詳細介紹一下VenorGeM® OneStep支原體檢測試劑盒。

使用方法

步驟

與經(jīng)典法大致相同：

樣品處理?試劑制備?體系建立?啟動(dòng)PCR反應?結果判定

樣品處理：

取100μl左右的細胞上清液

95℃孵育后離心，取適量用于后續qPCR。

細胞培養樣品易含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩定化處理。

試劑制備：

將緩沖液、預混液、陽(yáng)性對照等試劑按照說(shuō)明書(shū)要求，該離心的離心、該混合的混合，處理好后扣緊蓋子備用。

PCR體系建立：

在PCR管中，根據需要，加入樣品、陽(yáng)性對照、新鮮培養基（陰性對照），并且設置好重復孔，蓋好蓋子，震蕩混勻。

啟動(dòng)PCR反應：

按照所需參數，設置好PCR儀，啟動(dòng)程序（具體參數詳見(jiàn)產(chǎn)品使用說(shuō)明或是締一生物網(wǎng)站，點(diǎn)擊下方閱讀原文即可）。