被廣泛使用的方法
基于Venor®Gem qEP經(jīng)典法試劑盒的qPCR檢測法,目前使用較為廣泛,擁有高特異性、高靈敏度等特點(diǎn),還可以選配支原體和細菌DNA、支原體絕對定量標準品,來(lái)進(jìn)行特異性驗證、定量檢測。
經(jīng)典法pro版
基于Venor®Gem qOneStep一步法試劑盒的qPCR檢測法,是經(jīng)典法的升級版本,包含經(jīng)典法所有優(yōu)點(diǎn)。另外,內控已配置好,更加省時(shí)省力。
傳統認為的金標準
分離培養法被認為是支原體檢測的金標準,準確率比較高,但培養周期長(cháng),而且對于一些特定支原體無(wú)法培養。
操作步驟多但簡(jiǎn)單
DNA染色法檢測支原體雖然操作步驟較多,包含指示細胞培養,上清液共培養、染色等多個(gè)過(guò)程,但并不復雜,對技術(shù)要求相對沒(méi)有那么高。
今天我們就來(lái)介紹最后兩種常見(jiàn)檢測法
ELISA法和PCR法
廢話(huà)不多說(shuō)
我們直接上干貨
ELISA法
首先我們先來(lái)簡(jiǎn)單了解一下ELISA:
酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)寫(xiě)ELISA或ELASA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結合進(jìn)行免疫反應的定性和定量檢測方法。根據免疫吸附劑、酶聯(lián)物、結合物這些試劑的來(lái)源、樣本情況,檢測具體條件,可以分為夾心法、競爭法、間接法等不同類(lèi)型。
支原體檢測過(guò)程中用到的ELISA,一般采用的是夾心法,針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體,來(lái)檢測培養物中是否含有支原體。
先用純化過(guò)的支原體抗體包被微孔板,制成固相抗體。
往微孔板中依次加入支原體(Mycoplasmal),再與 HRP(一種雙功能試劑,通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物)標記的支原體抗體結合,形成抗體 -抗原-酶標抗體復合物。
經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成黃色。
最后用酶標儀分析結果:
顏色的深淺和樣品中的支原體( Mycoplasmal)呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm波長(cháng)下測定吸光度( OD值),通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中支原體濃度。整個(gè)過(guò)程時(shí)間比較短,一般三四個(gè)小時(shí)就能出結果。
整個(gè)過(guò)程除取樣外,還包括標準品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、結果分析,步驟比較多,且很多步驟都需要有一定經(jīng)驗的人操作才能保證準確性,因此對技術(shù)要求比較高。
另外,由于依賴(lài)抗體的特性,該方法能夠檢測的支原體種類(lèi)比較有限,對于沒(méi)有抗體的支原體,ELISA就無(wú)能為力了。
PCR法
常規PCR法:
根據支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設計引物,對待檢樣本DNA進(jìn)行擴增,通過(guò)對擴增產(chǎn)物的大小分析作出判斷。
以Venor®Gem OneStep支原體常規PCR檢測試劑盒為例,簡(jiǎn)單介紹一下實(shí)驗流程。
樣本處理
與qPCR類(lèi)似
取適量待檢測樣品上清
95℃孵育10min
以對樣品進(jìn)行穩定化處理
試劑制備
離心?按比例混合?靜置?混勻
PCR體系建立
設置好陰性對照、陽(yáng)性對照、重復孔
扣緊蓋子混勻
啟動(dòng)PCR反應
根據使用說(shuō)明設置好程序
電泳結果分析
191bp為內控對照條帶,表明PCR反應正常。
當樣本存在支原體污染時(shí),由于內控對照與支原體DNA存在競爭,內控對照條帶變弱(例如支原體DNA>1000拷貝)。
陽(yáng)性對照中支原體DNA>10000拷貝,內控對照條帶會(huì )*消失。
可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶,此條帶不影響檢測結果。
如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制,則內控對照條帶變弱(和陰性對照相比),此時(shí)應先進(jìn)行DNA抽提(推薦使用:Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒),然后再檢測。
常規PCR的優(yōu)點(diǎn)就是檢測時(shí)間短:2-3小時(shí)即可出結果、靈敏度高、特異性強、操作簡(jiǎn)單。
缺點(diǎn)也很明顯,用PCR檢測已經(jīng)進(jìn)行過(guò)支原體滅活的樣品時(shí),由于支原體DNA依然存在,所以此時(shí)PCR結果仍為陽(yáng)性,說(shuō)明該樣品曾經(jīng)感染過(guò)支原體。
另外不同廠(chǎng)家的試劑盒差異比較大,需要謹慎選擇。
ELISA法
至此,幾種常規的檢測方法都已經(jīng)介紹給大家啦,給大家做了個(gè)小總結,供參考。有些單一的檢測方法并不嚴謹,需要結合實(shí)驗情況,聯(lián)合使用多種方法進(jìn)行檢驗,確保結果的可信度。
培養法是金標準,但是周期長(cháng),有些支原體還檢測不到;
染色法普適性強,操作簡(jiǎn)單,但是對于支原體數量有要求,也容易有假陽(yáng)性假陰性;
ELISA法耗時(shí)短,但是對操作人員要求比較高,需要獲得相應抗體才可以進(jìn)行試驗;
常規PCR法,基本包含了上面所有的優(yōu)點(diǎn),但是不能分辨支原體的死活,用到的試劑盒也是良莠不齊;
qPCR法,涵蓋上述所有優(yōu)點(diǎn),但是對實(shí)驗人員有一定的經(jīng)驗要求,因此該方法目前也是十分常用的檢測手段。
不同的是,“一步法"試劑盒中,直接將內控添加到預混液中,使用起來(lái)更加方便、節省時(shí)間。
下面我們就來(lái)詳細介紹一下VenorGeM® OneStep支原體檢測試劑盒。
使用方法
步驟
與經(jīng)典法大致相同:
樣品處理?試劑制備?體系建立?啟動(dòng)PCR反應?結果判定
樣品處理:
取100μl左右的細胞上清液
95℃孵育后離心,取適量用于后續qPCR。
細胞培養樣品易含豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩定化處理。
試劑制備:
將緩沖液、預混液、陽(yáng)性對照等試劑按照說(shuō)明書(shū)要求,該離心的離心、該混合的混合,處理好后扣緊蓋子備用。
PCR體系建立:
在PCR管中,根據需要,加入樣品、陽(yáng)性對照、新鮮培養基(陰性對照),并且設置好重復孔,蓋好蓋子,震蕩混勻。
啟動(dòng)PCR反應:
按照所需參數,設置好PCR儀,啟動(dòng)程序(具體參數詳見(jiàn)產(chǎn)品使用說(shuō)明或是締一生物網(wǎng)站,點(diǎn)擊下方閱讀原文即可)。