細胞培養是一種無(wú)菌技術(shù),要求工作環(huán)境和條件必須保證無(wú)微生物和不受其他有害因素的影響。為防止微生物污染和有害因素的影響,細胞培養室要求環(huán)境清潔,空氣清新、干燥、無(wú)塵。
細胞培養實(shí)驗室由無(wú)菌操作區、孵育區、制備區、儲藏區、清洗和消毒滅菌區6部分組成,這些區域的共同特點(diǎn)是房間要寬敞、明亮,地面要便于清潔、防滑,墻壁的質(zhì)地光滑堅硬,儀器設備布局合理,方便操作,避免交叉干擾,陳設簡(jiǎn)潔,便于清掃。
一、無(wú)菌室
無(wú)菌室的結構:一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。
無(wú)菌室的消毒和防污染:為保持無(wú)菌狀態(tài),經(jīng)常消毒是必要的,通常采用每日(使用前)紫外照射(1-2小時(shí)),每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸(2小時(shí))和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。實(shí)際工作中,要根據無(wú)菌室建筑材料的差異來(lái)選擇合適的消毒方法。
此外,還應注意防止無(wú)菌室的污染。造成無(wú)菌室污染的可能包括:送入無(wú)菌室的風(fēng)沒(méi)有被過(guò)濾除菌;進(jìn)出無(wú)菌室時(shí),能使外界空氣直接對流進(jìn)無(wú)菌室的操作間;等。
二、超凈工作臺
工作原理:鼓風(fēng)機驅動(dòng)空氣通過(guò)高效過(guò)濾器得以?xún)艋?,凈化的空氣被徐徐吹過(guò)臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走,使工作區構成無(wú)菌環(huán)境。根據氣流在超凈工作臺的流動(dòng)方向不同,可將超凈工作臺分為側流式、直流式和外流式三種類(lèi)型。
超凈臺的使用與保養:超凈臺的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜,過(guò)大、過(guò)小均不利于保持凈化度;使用前最好開(kāi)啟超凈臺內紫外燈照射10-30分鐘,然后讓超凈臺預工作10-15分鐘,以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài);使用完畢后,要用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈,以保證超凈臺無(wú)菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。
德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑,或濕巾擦拭 5-10分鐘清除,對支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無(wú)殘留, 無(wú)腐蝕, 無(wú)致癌性,操作簡(jiǎn)單方便。
qPCR法介紹:
熒光定量PCR法(qPCR):是在常規PCR基礎上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記,使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光,利用熒光信號的變化和配套軟件,進(jìn)行DNA擴增反應的實(shí)時(shí)監測,簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR。
優(yōu)點(diǎn):①靈敏度高、特異性強。
②時(shí)間短,2-3小時(shí)出結果。
③檢測結果可定量。
④操作簡(jiǎn)便。
缺點(diǎn):①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結果會(huì )出現假陽(yáng)性。(可用培養法做補充驗證)
②不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內在設計不同),需謹慎選擇,盡量在專(zhuān)業(yè)人員推薦指導下使用