帶您了解RT-PCR引物/探針

一、產(chǎn)品用途：

RT-PCR引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測和分析新guan病毒RNA。它僅用于研究，不用于臨床診斷。

二、產(chǎn)品描述：

1.該產(chǎn)品包括三個(gè)小管：

①橙蓋：  Mix（凍干粉），1管。

此管為新guan病毒引物/探針，可特異性擴增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會(huì )被檢測到【1】【2】。（該引物/探針依據WHO診斷參考實(shí)驗室公布的新guan病毒引物/探針序列而設計【1】。更多詳情可訪(fǎng)問(wèn)

如要檢測其他冠狀病毒，推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，貨號：271-1100。

②綠蓋： Positive Control RNA（陽(yáng)性對照RNA，凍干粉），1管。

此陽(yáng)性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。

③白蓋： PCR Grade Water（液體），1管。

2.使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級水（③白蓋）復溶，并分裝，避免反復凍融。

3.該引物/探針應與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,

貨號192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反應檢測。

4.檢測樣本需為抽提過(guò)的RNA樣本。

5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測，擴增的人RNA酶P基因（過(guò)程對照）用ROX™通道檢測，用以評估樣本的制備質(zhì)量。

三、產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.靶點(diǎn)特別。依據WHO國際標準，此引物探針為新guan病毒RdRp基因，而非市面上常見(jiàn)的ORF1ab和N基因或E基因。

2.陽(yáng)性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來(lái)自武漢的病毒株）。

3.主要組分為凍干粉，4℃保存，儲存運輸方便，性能穩定。

4.適用于科研中，各種來(lái)源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細胞和細菌等。

四、需用戶(hù)自己準備的試劑耗材和儀器：

1.RNA病毒檢測試劑盒（RT-qPCR法）（英文名：ConviFlex™ RT-Taq Mix，貨號192-0025/-0100/-0250）

2.熒光定量PCR儀（qPCR儀）

3.無(wú)DNase和RNase的qPCR反應管

4.離心機

5.移液器及帶濾芯吸頭（不含DNase和RNase）

6.用戶(hù)自己提取的RNA或現成的RNA樣品。（抽提過(guò)程建議使用商品化的RNA提取試劑盒完成，如MB廠(chǎng)家的：

【病毒RNA提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Kit，貨號611-1010/-1050/-1250）

或【病毒RNA拭子提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit，貨號611-2250）。

五、操作注意事項：

該引物/探針應僅由經(jīng)過(guò)培訓的實(shí)驗室人員使用。

始終穿上合適的防護服和戴一次性手套。

根據樣品類(lèi)型，應謹慎處理所有樣品。請遵循WHO推薦的方法處理樣本。

該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據當地法規丟棄。

六、操作步驟：

步驟1. 試劑制備

①橙蓋Mix引物探針凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入525lPCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

②綠蓋Positive Control RNA陽(yáng)性對照凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入105lPCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。

步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl反應體積）

（1）1個(gè)反應需要加入：酶預混液 （自備的紅蓋預混液）10l ，

橙蓋（復溶的Mix引物/探針）5l

（紅蓋預混液 來(lái)自MB公司的【RNA病毒檢測試劑盒】（RT-qPCR法），

英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號192-0025/-0100/-0250，需單獨購買(mǎi)）

（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。

（3）每個(gè)PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本（抽提后的RNA），

或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對照，或5μl PCR級水作為無(wú)模板對照，或5μl陽(yáng)性對照RNA。

（4）緊扣PCR管，然后短暫離心。

（5）將PCR管放置qPCR儀上，緊上頂蓋。

步驟3. 設置qPCR程序

1個(gè)循環(huán)： 55 ℃，10分鐘

1個(gè)循環(huán)： 94 ℃，3 分鐘

45個(gè)循環(huán)：94 ℃，15秒

58℃，30秒

步驟4. 啟動(dòng)程序

七、使用注意事項：

1.使用前應認真閱讀說(shuō)明書(shū)。

2.來(lái)自不同批次的試劑不能混合。

3.試劑盒內的試劑應始終作為一個(gè)整體溶解分裝。

4.試劑盒應在效期內使用。

5.每次PCR至少應設置一個(gè)陽(yáng)性對照。每次PCR至少應設置一個(gè)陰性對照和/或一個(gè)無(wú)模板對照。如果實(shí)驗者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實(shí)驗室提供的對照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照，對于確認結果的可靠性或用于排除故障非常有意義。

6.建議在無(wú)RNA和DNA污染的條件下進(jìn)行RT-PCR，以避免操作過(guò)程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號15-2025，預先清潔實(shí)驗環(huán)境。）

7.盡量減少RNA樣品的凍融次數，同時(shí)避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風(fēng)險。（RNA降解會(huì )極大地限制了RT-qPCR反應的性能）。請確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測。

8.樣本制備過(guò)程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會(huì )降低qPCR的準確性。