環(huán)境因素

1．無(wú)菌環(huán)境

無(wú)毒和無(wú)菌是體外培養細胞的首要條件。細胞在活體內，解毒系統和免疫系統可抵抗微生物或其他有害物質(zhì)的入侵，但細胞在體外培養的過(guò)程中，缺乏機體免疫系統的保護而喪失對微生物的防御能力和對有害物質(zhì)的解毒能力。為保證細胞能在體外環(huán)境中生長(cháng)繁殖，必須要確保無(wú)菌工作區域、良好的個(gè)人衛生、無(wú)菌試劑和培養基以及無(wú)菌操作。

常見(jiàn)的微生物污染有支原體、細菌、真菌。支原體無(wú)致死毒性，可與細胞長(cháng)期共存，對細胞有潛在影響，但體積小，不易鑒別，可借助于地衣紅或Hoechst33342染色來(lái)進(jìn)行檢測。細菌增殖快，在短時(shí)間內即可大量擴增，并產(chǎn)生毒素殺死細胞。真菌的種類(lèi)繁多，肉眼可見(jiàn)，漂浮于培養液面上，可呈絲狀、管狀或樹(shù)枝狀等。

2.合適的溫度

一般哺乳類(lèi)與禽類(lèi)細胞在體外培養的適宜溫度是37～38℃，不適宜的環(huán)境溫度會(huì )影響細胞的生長(cháng)。細胞對低溫的耐受能力要強于對高溫的耐受能力，在低溫下，細胞的代謝活力及核分裂能力降低。若溫度不低于0℃，雖然細胞代謝受到影響，但無(wú)損傷作用；25～35℃時(shí)，細胞以緩慢的速度生長(cháng)；但若被置于40℃數小時(shí)，則不僅不利于細胞生存、生長(cháng)，甚至可導致其死亡。

3.適宜的滲透壓

高滲溶液或低滲溶液會(huì )引起細胞發(fā)生褶皺、腫脹、破裂。因此，滲透壓是體外培養細胞的重要條件之一。多數體外培養的細胞對滲透壓都有一定的耐受能力，實(shí)際應用中，260～320mmol/L的滲透壓可適用于大多數細胞。

4．氣體環(huán)境與pH

細胞的體外培養需要理想的氣體環(huán)境，氧氣、二氧化碳是細胞生存的必要條件。氧氣參與細胞的三羧酸循環(huán)，為細胞生存、代謝與合成提供能量；二氧化碳既是細胞的代謝產(chǎn)物，是細胞生長(cháng)的必需成分，又與維持培養液的pH有關(guān)。大多數細胞適宜的pH范圍往往是7.2～7.4。在開(kāi)放式培養中，以5%的二氧化碳氣體比例為宜。

營(yíng)養條件

1．培養基

細胞培養基包含細胞生長(cháng)所需的各種營(yíng)養物質(zhì)，包括碳水化合物、氨基酸、無(wú)機鹽、維生素等。針對不同細胞的營(yíng)養需求，有多種合成培養基可供選擇，如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。

2．其他添加成分

在各種合成培養基提供基礎營(yíng)養物質(zhì)之外，還需根據不同細胞和不同的培養目的添加其他成分，如血清、因子等。

血清提供的是細胞外基質(zhì)、生長(cháng)因子和轉鐵蛋白等重要物質(zhì)，常用的是胎牛血清。要根據不同的細胞和不同的研究目的決定添加血清的比例。10%～20%的血清能維持細胞較快的生長(cháng)增殖速度，稱(chēng)為生長(cháng)培養液；為維持細胞緩慢生長(cháng)或不死，添加2%～5%的血清即可，稱(chēng)為維持培養液。但血清中也存在有害于細胞生長(cháng)和繁殖的物質(zhì)，如補體、免疫球蛋白和一些生長(cháng)抑制因子；成分不明確，影響對結果的分析；不同動(dòng)物、不同批次的血清活性差別較大，影響培養效果的穩定性。

谷氨酰胺是細胞生長(cháng)重要的氮源，在細胞生長(cháng)代謝過(guò)程中起重要作用，但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，故谷氨酰胺需在使用前添加。

為防止污染，培養基中還需添加一定量的抗生素，常用抗生素名稱(chēng)、濃度及敏感性如下表。

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