都是qPCR，結果為何差距這么大？

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，應用該原理的熒光探針，是由熒光基團+DNA寡核苷酸+淬滅基團構成。

探針由5’端標記有熒光報告基團、目標基因特異性結合的寡核苷酸序列以及3’端標記有淬滅基團以及與組成。

自然狀態(tài)下，探針完整，熒光報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，儀器不會(huì )檢測到熒光信號。

當存在目標序列時(shí)，目標DNA變性解鏈，熒光探針特異性結合到目標基因處。引物也結合在目標基因上，Taq酶又名DNA聚合酶，能將核苷酸添加到引物中，引物開(kāi)始延伸。

Taq酶還具有5’-3’核酸外切酶活性。當引物延伸至探針結合處，可將探針水解，使熒光報告基團和淬滅基團分離，進(jìn)而被qPCR儀檢測到熒光信號，熒光信號的強度與擴增得到的DNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線(xiàn)"，通過(guò)熒光信號的強度反映出體系中雙鏈DNA的濃度。

熒光探針有許多不同種類(lèi)，以應對不同的實(shí)驗需求，該方法特異性高，已經(jīng)被廣泛地應用于基因檢測、病原體和病毒檢測、疾病耐藥基因篩查等領(lǐng)域。

該方法用到一種非特異性雙鏈DNA熒光染料，被激發(fā)后，顯示為綠色熒光。

該染料以一種非特異性方式，與雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區域相結合。游離的染料熒光信號微弱，在進(jìn)行qPCR擴增生成dsDNA時(shí)，染料逐漸與dsDNA結合，熒光信號被很大程度放大，熒光信號的強度與擴增得到的dsDNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線(xiàn)"，通過(guò)熒光信號的強度反映出體系中dsDNA的濃度。