『支原體檢測方法』到底應該怎樣選？

生物醫藥與支原體檢測

在疫苗、生物藥、細胞治療領(lǐng)域等領(lǐng)域，支原體檢測發(fā)揮著(zhù)重要作用，該項檢測是檢查藥物是否遭受外源因子污染的有效手段，是保證產(chǎn)品質(zhì)量的重要質(zhì)控途徑。

我國藥典中有提到，在一些領(lǐng)域需要進(jìn)行支原體檢測。包括主細胞庫、工作細胞庫、生產(chǎn)終末細胞、檢定細胞、病毒種子批和病毒收獲液、細胞培養相關(guān)材料如培養基、胰酶、臨床治療用干細胞和免疫細胞、新生牛血清以及雜交瘤細胞等。

常見(jiàn)的支原體檢測方法有以下幾種：

• 培養法

• 指示細胞法

• 核酸法

• ELISA法

琳瑯滿(mǎn)目的檢測方法這么多，究竟該怎么選？本期內容盤(pán)點(diǎn)了幾種常見(jiàn)的支原體檢測方法，希望能幫助小伙伴們選擇適合自己的方法。

方法一：分離培養法

方法

簡(jiǎn)單來(lái)講，就是從樣品細胞培養體系中取樣，接種到適宜支原體生長(cháng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì )在這種瓊脂平板上生長(cháng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。

優(yōu)點(diǎn)

操作規范的情況下，這種方法很少會(huì )出現假陰性結果，檢測精確度很高，因此被譽(yù)為支原體檢測金標準。

該方法也是《美國藥典》中認可的支原體檢測方法之一。

缺點(diǎn)

檢測時(shí)間太長(cháng)，支原體要長(cháng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。

還有一點(diǎn)就是，培養法無(wú)法對曾經(jīng)感染過(guò)的樣品做出判斷。

另一方面，盡管可以檢測絕大多數支原體種類(lèi)，分離培養法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. Hyorhinis。因此，該方法能鑒定的支原體種類(lèi)有限，成為它的另一個(gè)缺點(diǎn)。

方法二：指示細胞法

方法

將供試品接種于指示細胞（無(wú)污染標準化Vero 細胞或經(jīng)國家藥品檢定機構認可的其他細胞，供試品應對該細胞生長(cháng)無(wú)影響）中培養后，用特異熒光染料進(jìn)行染色，支原體中的核酸也可以被著(zhù)色。

因此，如果待檢測細胞中含有支原體，那么就會(huì )導致指示細胞被感染，進(jìn)而在細胞膜或培養基等處發(fā)現藍色熒光（支原體附著(zhù)在細胞膜上，也有可能游離在細胞培養基中）。

優(yōu)點(diǎn)

適用于一些不易培養的支原體，如豬鼻支原體，分離培養法對該支原體檢測并不可靠，但可用DNA染色法準確地檢測出來(lái)。屬于《美國藥典》中認可的方法。

缺點(diǎn)

時(shí)間較長(cháng)，從Vero細胞復蘇、傳代，再到收集上清后再次培養，有時(shí)甚至需要十幾天時(shí)間

存在假陽(yáng)性和假陰性的可能：如一些死亡細胞釋放出來(lái)的DNA會(huì )被染成藍色，出現假陽(yáng)性；或是由于熒光過(guò)若而出現假陰性使結果出現偏差，因此使用這個(gè)方法需要一定的經(jīng)驗。

方法三：核酸法

方法

通過(guò)對樣品中可能存在的支原體DNA進(jìn)行擴增并檢測，來(lái)判斷樣品是否被支原體污染。常用的核酸法主要有常規PCR法和熒光定量PCR法（qPCR），德國MB均有針對這兩種方法設計的高效試劑盒。

優(yōu)點(diǎn)

目前使用較為廣泛，擁有檢測速度快、高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，還可以選配支原體和細菌DNA、支原體絕對定量標準品，來(lái)進(jìn)行特異性驗證、定量檢測。

《美國藥典》中指出，核酸法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗證，可替代培養法以及指示細胞法這兩種經(jīng)典方法。

缺點(diǎn)

qPCR的檢測試劑盒成本相對較高。

總結

在選擇支原體檢測方法時(shí)，應從實(shí)際的應用場(chǎng)景出發(fā)。

如果只是想判斷樣品是否被支原體污染，無(wú)需出具報告等專(zhuān)業(yè)說(shuō)明，使用德國MB的常規PCR檢測試劑盒即可。

如果是疫苗、生物藥等產(chǎn)品的上市前檢測，需要出具專(zhuān)業(yè)的報告，則需要用到德國MB的qPCR支原體檢測試劑盒，同時(shí)配套使用標準品，完成方法學(xué)驗證，為了提高準確性和靈敏度，建議配合支原體DNA提取試劑盒一起使用。