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實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈式反應（qPCR）是一種高靈敏度、高精確度的分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測和量化DNA或RNA的數量。該項技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生物相關(guān)行業(yè)的檢測項目中，其中就包括支原體檢測。
我們都知道，支原體污染對于細胞相關(guān)的臨床項目危害巨大，支原體檢測是項目申報的必要環(huán)節。實(shí)現檢測的高靈敏度、高特異性，并盡可能縮短實(shí)驗時(shí)間，是非常有意義的。
藥典方法中，培養法和指示細胞法都各有缺點(diǎn)，而qPCR方法兼顧了二者的優(yōu)點(diǎn)，受到眾多從業(yè)人員的青睞。那么在實(shí)驗過(guò)程中，有哪些注意事項？本期內容，以德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor Gem qEP為例，盤(pán)點(diǎn)qPCR檢測支原體的關(guān)鍵點(diǎn)。
Venor Gem qEP試劑盒能檢測多種支原體、靈敏度高、遵循歐洲藥典流程要求。
Part.01 樣品處理
一般來(lái)說(shuō)，該試劑盒適用于細胞、細胞培養上清等物質(zhì)的支原體檢測。
當細胞長(cháng)至80%-90%時(shí)，收集樣品。此時(shí)可對樣品進(jìn)行95℃的孵育處理。
需要注意的是：細胞培養產(chǎn)物中可能存在PCR抑制物質(zhì)，例如：細胞顆粒、較大的樣品體積或其他生物材料（疫苗、石蠟包埋樣品等）、胎牛血清含量＞5%等情況，需要在進(jìn)行PCR之前，對樣品進(jìn)行DNA提取處理，以盡可能減輕無(wú)關(guān)因素對實(shí)驗結果的干擾。
這里推薦試用配套的德國MB支原體提取試劑盒：
有小伙伴可能會(huì )產(chǎn)生疑問(wèn)：培養基中的青霉素或者鏈霉素，會(huì )不會(huì )對實(shí)驗結果產(chǎn)生影響？
就目前有記錄的研究結果而言，沒(méi)有發(fā)現常用的“雙抗"會(huì )對檢測的靈敏度等造成影響。
Part.02 反應體系建立
在進(jìn)行支原體qPCR檢測時(shí)，需要設置合適的反應體系和條件。反應體系包括Mix、樣品DNA、緩沖液、內控等組分。反應條件包括擴增溫度、時(shí)間、周期數和熒光信號閾值等參數。
需要注意的是：需嚴格按照使用說(shuō)明中的參數進(jìn)行設置。隨意更改數值可能會(huì )影響檢測結果的準確性。
Part.03 結果解釋
FAM通道：檢測支原體熒光信號。
HEX通道：檢測內控對照熒光信號。
需要注意的是：支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多，FAM通道信號越高，檢測內控對照的HEX通道信號越低。
定量需基于Ct值和DNA標準曲線(xiàn)。
Ct＜40為陽(yáng)性結果。Ct≥40為陰性結果。
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