dPCR概念及操作步驟詳解

數字聚合酶鏈反應（Digital PCR，dPCR）是一種高度靈敏和準確的核酸檢測技術(shù)，它通過(guò)將目標分子在大量微小反應單元中進(jìn)行數字化擴增和檢測，實(shí)現對稀有或低拷貝數目標的可靠定量。本文將詳細介紹dPCR技術(shù)的原理，包括樣本分割、擴增、測定和數據分析的步驟，以幫助讀者深入理解這一先進(jìn)的生物分析技術(shù)。

引言

聚合酶鏈反應（PCR）作為一種常用的核酸擴增技術(shù)，已在分子生物學(xué)、醫學(xué)診斷和生物工程等領(lǐng)域發(fā)揮著(zhù)重要作用。然而，傳統PCR技術(shù)在檢測低拷貝數目標時(shí)存在靈敏度不足、精確度有限等局限性。為了克服這些限制，dPCR技術(shù)應運而生。

dPCR的基本原理

dPCR的基本原理是將樣本中的目標分子均勻地分割成許多微小反應單元，并在每個(gè)反應單元中進(jìn)行PCR擴增。通過(guò)對反應單元的陽(yáng)性和陰性結果進(jìn)行數字計數，可以確定目標分子的存在與否，從而實(shí)現精確定量。

dPCR的步驟

a. 樣本準備：首先，從樣本中提取目標DNA或RNA，并根據需要進(jìn)行適當的預處理，例如逆轉錄反應或DNA純化等。

b. 樣本分割：將樣本分割成大量微小反應單元，可以使用微滴數字PCR芯片、微流控芯片或數字PCR芯片等分割技術(shù)。每個(gè)反應單元包含零個(gè)或一個(gè)目標分子。

c. PCR擴增：在每個(gè)微小反應單元中進(jìn)行PCR擴增。由于每個(gè)反應單元中僅包含少量目標分子，使得擴增達到飽和狀態(tài)的概率較小，從而減少了PCR擴增效率對結果的影響。

d. 結果測定：通常使用熒光探針、探針水解或熒光染料等方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。根據產(chǎn)物是否達到熒光檢測閾值，可以判定每個(gè)反應單元是陽(yáng)性還是陰性。

e. 數據分析：將陽(yáng)性和陰性結果的數字計數與總反應單元數量相比較，即可得到目標分子的絕對拷貝數，實(shí)現對目標分子的精確定量。

dPCR技術(shù)的優(yōu)勢

a. 高靈敏度：dPCR可以檢測稀有或低拷貝數目標，比傳統PCR技術(shù)更加敏感。

b. 高準確性：由于數字化的特性，dPCR消除了PCR擴增效率的影響，提供更加準確和可靠的定量結果。

c. 抗抑制性強：dPCR在復雜樣本中的表現優(yōu)秀，對樣本中存在的抑制物質(zhì)較為抗拒。

d. 可重復性好：數字化的dPCR技術(shù)具有出色的可重復性，可以在不同實(shí)驗室和不同時(shí)間重現相同的結果。

結論

數字聚合酶鏈反應（dPCR）作為一種高度精確的核酸定量技術(shù)，已經(jīng)在許多領(lǐng)域展現出巨大的潛力和廣泛的應用前景。通過(guò)樣本分割、PCR擴增、結果測定和數據分析等步驟，dPCR能夠實(shí)現對稀有或低拷貝數目標的可靠定量，為基礎研究、臨床診斷和生物工程等領(lǐng)域的科學(xué)研究和技術(shù)應用提供了強有力的支持。隨著(zhù)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信dPCR將在未來(lái)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，推動(dòng)生物科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步和創(chuàng )新。