細胞培養實(shí)戰指南：如何做好細胞實(shí)驗？

細胞是生物體的基本結構和功能單位。

細胞培養是在人工環(huán)境下，將細胞種植或培養在培養皿或培養瓶中，提供適當的培養基和條件，使細胞能夠在體外持續生長(cháng)和繁殖的過(guò)程。

細胞培養實(shí)驗中，有一些細節，對于高效地完成實(shí)驗十分重要。本期內

容，盤(pán)點(diǎn)細胞實(shí)驗“實(shí)戰"過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)。

實(shí)驗前準備

1、明確細胞身份

在實(shí)驗正式開(kāi)始前，需要根據實(shí)驗目的，確定所需的細胞系。不同的細胞系在形態(tài)、生理、代謝和功能等方面有很大的差異。選擇適合研究目的的細胞系可以增加實(shí)驗的準確性和可靠性。

選擇來(lái)源靠譜的細胞系（細胞類(lèi)型、細胞來(lái)源、細胞代數等信息），根據不同細胞來(lái)源，尋找相應的細胞培養資料，明確培養基種類(lèi)、培養物添加量、培養條件（溫度、濕度、二氧化碳濃度）等。

2、實(shí)驗室環(huán)境清潔

在細胞實(shí)驗開(kāi)始前，需要對細胞培養環(huán)境進(jìn)行清潔消毒甚至是滅菌處理。儀器、培養室墻壁與地面、培養室空間都應采取對應的清潔措施。

3、準備實(shí)驗材料

選擇高品質(zhì)的實(shí)驗耗材與試劑，盡可能選擇無(wú)菌化處理過(guò)后的，若非無(wú)菌級，則需自行滅菌后才可用于細胞培養。

胎牛血清是許多細胞培養實(shí)驗中一種重要的添加物。提供對維持細胞指數生長(cháng)的激素，基礎培養基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養物，以及主要的低分子營(yíng)養物。還能夠提供結合蛋白，能識別維生素、脂類(lèi)、金屬和其他激素等，能結合或調節它們所結合的物質(zhì)活力。

Ausbian進(jìn)口特級胎牛血清，精選內毒素更低批次（≤3EU/ml），澳洲血源，是細胞典藏等重大項目十幾年的穩定供應品牌。新批次在試用前，提供試用服務(wù)，養細胞更放心。全程冷鏈運輸，減少反復凍融對胎牛血清品質(zhì)的影響。

實(shí)驗過(guò)程

細胞復蘇

——液氮中取出的細胞，待液氮揮發(fā)后，馬上將細胞凍存管置于37℃水浴中輕輕搖動(dòng)使快速融化（盡量控制在2min內，時(shí)間過(guò)長(cháng)了可能會(huì )影響細胞的狀態(tài)）。在解凍時(shí)，凍存管瓶口盡量控制在水面以上。

——解凍后，將凍存管轉移到無(wú)菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。

——將細胞懸液轉移至，裝有37℃預熱的培養基離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，棄上清。

——重新加入經(jīng)預熱培養基重懸細胞，以適宜密度，一般約為(3~5)×10^5個(gè)/ml密度接種到培養器皿（直徑10cm）中。放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀(guān)察細胞的情況。

細胞傳代

——用移液器吸取并丟棄使用過(guò)的細胞培養基（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染），并用PBS緩慢沖洗細胞2次。

——以直徑10cm的培養皿為例，向培養皿中加入500μl胰蛋白酶-EDTA（根據各細胞的使用說(shuō)明，選擇合適的濃度）消化液，輕輕搖動(dòng)培養皿，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育（一般2分鐘左右即可）。鏡下觀(guān)察，發(fā)現胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，傾斜培養瓶時(shí)細胞層能自然流即可終止，此時(shí)應加入2-3ml含血清的培養液終止消化（細胞的解離時(shí)間標準可能偏差，根據細胞來(lái)源確定，有些細胞屬于半貼壁，無(wú)需胰蛋白酶也可解離）。

——吸取所有培養皿內的液體，沿培養皿底部緩慢吹打，重復該動(dòng)作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個(gè)懸液（吹打過(guò)程中應盡量避免氣泡的產(chǎn)生）。

——把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后棄上清。

——加入培養基重懸成單細胞懸液。按實(shí)驗所需的細胞量添加到新的培養皿中，將培養皿37 ℃ 孵育，每天觀(guān)察細胞的貼壁情況。

注意：向培養皿加液體時(shí)，建議從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細胞層，前后搖晃容器數次，最后移棄沖洗液。若是懸浮細胞傳代培養，過(guò)程中省消化步驟。

細胞凍存

——按照“細胞傳代"中的步驟收集細胞。

——加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應細胞的培養基），重懸細胞，使細胞的終密度為(5~10)×10^5個(gè)/ml，移入細胞凍存管中。

——程序降溫，更推薦使用程序降溫盒。若手動(dòng)進(jìn)行降溫，凍存的一般程序為降溫速度1～2℃/ min；當溫度達-25℃以下時(shí)，可將降溫速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。

污染控制

1、設備的清潔與滅菌

在開(kāi)始任何細胞培養實(shí)驗之前，必須對所有設備、耗材和試劑進(jìn)行滅菌處理，當然，我們推薦實(shí)驗人員盡量選擇商品化的無(wú)菌試劑。

滅菌方法包括高壓滅菌、過(guò)濾、紫外線(xiàn)照射、乙醇噴灑或擦拭、消毒清潔試劑噴灑或擦拭等。

2、環(huán)境的清潔與滅菌

所有細胞培養工作應在無(wú)菌和清潔的環(huán)境中進(jìn)行。因此要對實(shí)驗環(huán)境進(jìn)行清潔與滅菌。

包括實(shí)驗前對實(shí)驗空間定期清潔，包括桌面、地面、墻面、生物安全柜操作臺等，開(kāi)始實(shí)驗前，還應打開(kāi)生物安全柜中的紫外線(xiàn)燈進(jìn)行照射滅菌。

除了常規的消毒試劑，這里推薦使用德國Minerva Biolabs的Mycoplasma-off支原體祛除噴霧劑，不僅對支原體起作用，還能高效清除并預防細菌、真菌等污染物。水浴鍋、培養箱水槽等環(huán)境，可以添加Water Shield™，有效預防水源中的支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子的污染。

3、正確處理實(shí)驗材料

正確處理實(shí)驗材料，實(shí)驗操作應符合相關(guān)規定、避免交叉污染。包括佩戴適當的個(gè)人防護設備，如手套、口罩；及時(shí)更換移液器一次性器具等操作。

4、實(shí)驗室合理布局

在實(shí)驗過(guò)程中，嚴格遵守實(shí)驗室中物品擺放準則，以培養箱舉例：培養皿擺放密度應合理，宜少不宜多等。

5、定期監測培養物

定期監測培養物，對于及早發(fā)現和解決而言，也是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。這包括在顯微鏡下檢查培養物狀態(tài)、肉眼觀(guān)察培養基的形態(tài)、顏色等變化等。必要時(shí)可以使用PCR技術(shù)定期測試微生物污染的存在。