指示細胞培養法又稱(chēng)為指示細胞法、DNA染色法,該方法的實(shí)驗思路是:
培養指示細胞-樣品上清液收集-上清液接種-染色觀(guān)察結果
具體包含以下幾個(gè)步驟:
將供試品接種于指示細胞(無(wú)污染的Vero 細胞或經(jīng)國家藥品檢定機構認可的其他細胞,供試品應對該細胞生長(cháng)無(wú)影響。下面以Vero細胞為例)中培養后,用特異熒光染料(如Hoechst 33258)染色,支原體中的核酸也可以被著(zhù)色,因此,如果待檢測細胞中含有支原體,那么就會(huì )導致指示細胞被感染,進(jìn)而在細胞膜或培養基等處發(fā)現藍色熒光(支原體附著(zhù)在細胞膜上,也有可能游離在細胞培養基中)。
指示細胞培養:將指示細胞復蘇、傳代,調整至最佳狀態(tài),留出適宜的量備用。
樣品上清液收集:無(wú)抗生素培養基中加入待檢測樣品后,細胞需至少傳一代,然后取細胞已長(cháng)滿(mǎn)且3 天未換液的細胞培養上清液待檢。(為了對待檢測樣品中的支原體進(jìn)行富集)
上清液接種:在制備好的指示細胞培養板中加入一定量的待檢細胞培養上清,36°C培養3-5 天。指示細胞培養物至少傳代1 次,末次傳代培養可用6孔板培養3-5 天。
染色觀(guān)察:吸出培養孔中的培養液,加入固定液,放置5分鐘。吸出固定液后進(jìn)行10min的二次固定,再次吸出固定液,使蓋玻片在空氣中干燥。加DNA 染料工作液5ml,加蓋,室溫放置30分鐘,漂洗3次,干燥,封片。用熒光顯微鏡觀(guān)察。
熒光顯微鏡下可見(jiàn)細胞表面或培養基中,有大小不等、不規則的藍色熒光著(zhù)色顆粒,則說(shuō)明有可能存在支原體污染。
對于DNA染色法方法,優(yōu)缺點(diǎn)很明顯的:
優(yōu)點(diǎn):
1、適用于一些不易培養的支原體,如豬鼻支原體,分離培養法對該支原體檢測并不可靠,但可用DNA染色法準確地檢測出來(lái)。
2、操作步驟雖然多,但都相對簡(jiǎn)單
3、靈敏度尚可。
缺點(diǎn):
1、時(shí)間較長(cháng),從Vero細胞復蘇、傳代,再到收集上清后再次培養,有時(shí)甚至需要十幾天時(shí)間
2、存在假陽(yáng)性和假陰性的可能:如一些死亡細胞釋放出來(lái)的DNA會(huì )被染成藍色,出現假陽(yáng)性;或是由于熒光過(guò)若而出現假陰性使結果出現偏差,因此使用這個(gè)方法需要一定的經(jīng)驗。