葉酸的檢測方法

近年來(lái)，葉酸對人類(lèi)健康的影響越來(lái)越受重視，對葉酸檢測要求也就越來(lái)越高。由于各種樣品中成分復雜，葉酸的測定也比較復雜。葉酸含量的測定方法很多，例如：

1、液相色譜法( HPLC)

操作方法和所用藥品分析相似：稱(chēng)取磨細的樣品置于離心管中，加入流動(dòng)相液體，超聲波提取15 min－30 min。取出后加入流動(dòng)相定容，搖勻后過(guò)濾，濾液用 HPLC 法分析。

液相色譜法的特點(diǎn)是測定結果準確、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、分析速度快、分離效果好，是近年來(lái)發(fā)展速度較快的測定葉酸的方法，分析操作方法和所用藥品分析相似，適合檢測純品，但分析成本高，液相色譜儀價(jià)格及日常維護費用貴。

2、液相柱后衍生法

選用含 12%乙腈 +88% 0. 05 mmo l /L 磷酸二氫鉀溶液(pH =3.5)作為流動(dòng)相，流速 1 m l /m in， 經(jīng) ODS C - 18反相色譜柱分離, 柱溫設為 40℃，以0.5%過(guò)二硫酸鉀溶液為衍生劑，流速為0.3  mL /min， 反應溫度為 60℃，使用熒光檢測器檢測定量，激發(fā)波長(cháng)為365 nm，發(fā)射波長(cháng)為 450 nm，外標法測定葉酸含量。

本法利用葉酸經(jīng)氧化劑氧化后具有熒光特性，采用柱后衍生法熒光檢測器測定，大大提高了檢測葉酸的靈敏度(較紫外檢測提高了2個(gè)數量級)，避免了使用離子對試劑傷害柱子且能夠準確定量，本方法簡(jiǎn)單、快捷、靈敏，滿(mǎn)足日常分析要求。

3、同位素放射免疫法

同位素放射免疫法對多谷氨酸葉酸反應的相對靈敏度有較大的差別，隨著(zhù)葉酸濃度增加，反應的相對靈敏度增加，但多谷氨酸葉酸的反應曲線(xiàn)不可能與單谷氨酸葉酸的反應曲線(xiàn)重合；另一方面，多谷氨酸葉酸與結合蛋白的親合性與單谷氨酸葉酸相比較高，不同的單谷氨酸葉酸衍生物反應靈敏度不同，放射免疫法也不適用于檢測單谷氨酸葉酸衍生混合物。

該方法具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，同時(shí)由于葉酸放射免疫試劑盒的出現，很快得到普及，尤其廣泛應用于臨床實(shí)驗室。但放射免疫法可用于檢測和評價(jià)葉酸的營(yíng)養狀況，從定量檢測的角度來(lái)講，難以得到準確的葉酸質(zhì)量分數值。

4、微生物測定法

此方法適用于食品中葉酸含量的測定，根據細菌對葉酸的營(yíng)養需求，在一系列不含葉酸的培養基中從低到高添加已知含量的葉酸以及待測的食品樣品，在37°C培養18h。因為有了葉酸，細菌能生長(cháng)得很好，培養液發(fā)生渾濁。細菌越多，培養基就越渾濁，吸光度就越高。通過(guò)已知含量的葉酸樣品的吸光度，以及待測樣品的吸光度，就能確定待測樣品中的葉酸含量。

微生物測定法的特點(diǎn)是靈敏度高，樣品中被測物量含量極低時(shí)也能被測出。樣品處理簡(jiǎn)單，不需要一系列的提純步驟，前處理操作步驟簡(jiǎn)單。微生物法是目前應用為廣泛的，也是美國*分析化學(xué)家協(xié)會(huì )的推薦方法，我國食品安全國家標準中關(guān)于嬰幼兒食品和乳品中葉酸含量的測定，微生物法是測定葉酸的方法。

上HiMedia公司生產(chǎn)的葉酸測定用培養基（貨號：M543），該培養基的特點(diǎn)是不含痕量葉酸，有效避免標準曲線(xiàn)偏移和本底過(guò)高，測定結果準確可靠，由認證的GMP，CE和FDA，ISO9001，ISO13485等證書(shū)，成分符合《GB5009.211-2014 食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》。

5、離子捕獲法

該技術(shù)是目前葉酸檢測技術(shù)中較新的研究成果，即在實(shí)驗中，樣品加入變性劑后葉酸與內源性結合蛋白分離，釋放后的葉酸再與帶有大量陰離子的親合試劑結合，合成產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離子捕獲池而與陽(yáng)離子纖維結合，后通過(guò)堿性磷酸酶與蝶酸（葉酸的類(lèi)似物）結合物對葉酸結合蛋白上游離結合位點(diǎn)的探查，定量分析樣品中葉酸的質(zhì)量分數。當離子捕獲法測定血清或紅細胞中的葉酸時(shí)，其結果與同位素放射免疫法的結果具有良好的相關(guān)性。

該方法主要用于臨床測定血清或紅細胞中的葉酸含量。

6、聚合酶鏈 － 限制性片段長(cháng)度多態(tài)性測定法

聚合酶鏈－限制性片段長(cháng)度多態(tài)性測定原理是擴增產(chǎn)物用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR 產(chǎn)物純化后酶切，經(jīng)3 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外凝膠成像系統下觀(guān)察帶型，根據帶型判讀基因型。通過(guò)基因型頻率計算等位基因頻率，以Hardy－Weinberg 平衡檢驗確認樣本的群體代表性。

此方法檢測速度快，無(wú)離子輻射，操作簡(jiǎn)單，可作為一般實(shí)驗室常規檢查和臨床應用。